多酶级联实现全细胞催化合成硫酸软骨素A.pdf

摘要

摘要

硫酸软骨素A(CSA)是一类有价值的糖胺聚糖，在保健食品、生理医药和生物材料

等领域被广泛应用。与传统的物理提取和化学合成方法相比，酶转化法合成CSA具有

转化条件温和、转化率高和产物质量均一的优势，是目前最有潜力的生物制备方法之一。

但是关键碳水化合物磺基转移酶11(CHST11)存在诸多问题，包括表达困难、热稳定性

差和酶活力低，并且作为底物之一的腺苷3-磷酸5-磷酸硫酸(PAPS)价格极其昂贵。另

外，酶法转化也带了高成本的分离纯化步骤和成本，这些都限制了CSA的规模化生产。

5-(ATP)PAPS

本研究开发了以较便宜的辅因子三磷酸腺苷为底物实现供应的方法，并

偶联磺基转移路径合成CSA。我们综合了辅因子工程、蛋白质工程和表面展示策略，提

A

高了全细胞合成硫酸软骨素的催化效率。主要研究结果如下：

(1)A

一锅法生产硫酸软骨素路径的设计、构建和验证：首先通过文献调研，确定

了来源于乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)的ATP磺化酶(KlATPS)、来源于产黄青

霉(Penicilliumchrysogenum)的5-磷酸硫酸腺苷激酶(PnAPSK)为最佳路径酶；以酶活为

指标，确定了智人(Homosapiens)来源的磺基转移酶CHST11(HsCHST11)作为最佳路径

-1

酶。在体外进行了三酶级联的纯酶催化反应，利用质谱确定了CSA的生成(10g·L底物，

硫酸化程度：38.8%)，验证了路径的可行性。接着，在体外确定了

KlATPS:PcAPSK:HsCHST11三酶的最佳酶活比例为1:1.5:3，硫酸化水平为42.3%。最后

测定了路径酶的比活力和转化率参数，确定了HsCHST11为关键的限速酶。

(2)蛋白质工程改造CHST11提高其热稳定性和催化效率：以AlphaFold2构建的3D

5M1M2M3M4M5M2M5

模型为基础，预测得到了个突变体，，，和。其中和分别

oo

T10.5h10.0h66.0C65.5CM2M5

将半衰期和值提高至、和、。将和中的有益位点

m

2hoo

整合后获得突变体M6，半衰期、T和T值提高至11.5h、47.4C和68.5C。结果表

50m

明，突变体中的位点优化了表面电荷、增加了酶的亲水性以及对稳定性具有能量贡献。

在M6的基础上，通过MD模拟研究了控制底物PAP(S)进出的关键“门环”结构的开放

闭合机制，并以此提出了两个突变策略。经过多轮突变获得了最优突变体M12，硫酸软

A68.1%M12(WT)

骨素硫酸化水平达到了；动力学参数表明，与野生型相比，比酶活

132.4U·g-1WT2.1K4.21mMWT0.64k/K

增加到，是的倍。为，是的。而