其他分子诊断检测技术.ppt

（一）DHPLC的基本原理DHPLC的分离系统DHPLC分离DNA的原理DHPLC检测突变的原理DHPLC第30页，课件共77页，创作于2023年2月1.DHPLC的分离系统DHPLC1.色谱柱的填料特性：电中性，疏水性固定相:C18基质：聚苯乙烯-二乙烯基苯（PS-DVB)2.离子对试剂：三乙基铵醋酸盐（TEAA）特性：带正电荷，疏水性3.流动相：乙腈特性：通过改变浓度，将DNA分子按结合程度的不同，逐步洗脱下来。第31页，课件共77页，创作于2023年2月PO3-TEAAC182.DHPLC分离DNA的原理DHPLC第32页，课件共77页，创作于2023年2月DHPLC3.DHPLC检测突变的原理变性后，缓慢退火分离手段：非变性分离部分变性分离完全变性分离第33页，课件共77页，创作于2023年2月（二）临床应用乳腺癌相关基因BRCA1、BRCA2及ATM等疾病相关基因的分子检测；短的串联重复序列的基因分型；肿瘤样本中杂合性缺失的检测；Y染色体和常染色体DNA序列的筛查酵母、拟南芥、果蝇及小鼠的基因组作图及基因克隆。DHPLC第34页，课件共77页，创作于2023年2月（三）方法学评价优点：具有更高的准确性和敏感度。DHPLC检测特性SSCPTGGE/DGGEDHPLCDNA测序检出范围300bp100-500bp150-600bp0.5%的变异20%的变异检出率50%-95%40%-100%100%80%工作度需要特殊的GC夹辅助，增加了工作量快速，2-3min费时费力第35页，课件共77页，创作于2023年2月错配接合蛋白质截短测试法（PTT）：又称为体外蛋白质合成检测技术(IVPS),只检测与疾病相关的突变，即检测使蛋白不能全长翻译的突变。五、错配接合蛋白质截短测试法

（proteintruncationtest,PTT)第36页，课件共77页，创作于2023年2月（一）PTT的原理PTT检测基因缺失、异常的复制或剪接检测翻译终止突变第37页，课件共77页，创作于2023年2月（二）临床应用最早被用于杜氏肌营养不良的检测；家族性腺瘤样息肉病；遗传性硬纤维瘤病；共济失调—毛细血管扩张症；遗传性乳腺癌；卵巢癌等。PTT第38页，课件共77页，创作于2023年2月（三）方法学评价优点：PTT不仅可检测出只与疾病相关的蛋白截短突变，还能检测出在RNA形成过程中发生的突变。可以直接采用mRNA进行检测，减少了操作步骤，加快了分析进程；只鉴定引起疾病的截短突变，不会受到基因沉默的影响；截短蛋白质分子的长度指明了突变的位置，可以更方便地进行DNA测序分析以确定突变。第39页，课件共77页，创作于2023年2月DHPLC缺点：最佳检测范围为2kb的基因组或1.3-1.6kb的cDNA，因此对于序列较长、包含多个外显子的疾病基因，需要分几次进行检测；PTT因为凝胶的分辨率，而检测不出编码序列中小的插入或错义突变；引起RNA产量改变或使mRNA不稳定的突变可能被漏检。第40页，课件共77页，创作于2023年2月谢谢！第41页，课件共77页，创作于2023年2月第二节脉冲电场凝胶电泳交替采用两个方向的不均匀电场，使DNA分子在连续间隔交替的电场中，不断改变方向运动，从而将DNA按分子大小分开的电泳技术。脉冲电场凝胶电泳(pulsed-fieldgelelectrophoresis,PFGE)特点：能分离50kb-10Mb的DNA片段。第42页，课件共77页，创作于2023年2月在PFGE中，电场的方向、脉冲时间和电压大小可交替改变。在每次电场方向改变时，DNA分子都需要时间来改变其分子构型和迁移方向。DNA分子越大，分子构型转换所需的时间越长，转变迁移方向的时间也越长。不同大小的DNA分子，因为其改变泳动方向的时间不同，迁移速度也就不同，从而可以在脉冲电场中很好地分开。一、PFGE的原理第43页，课件共77页，创作于2023年2月二、PFGE的一般步骤真核或原核细胞包埋原位裂解限制性酶切脉冲电泳结果分析原位裂解获得完整的染色体DNA与琼脂糖混合制备包埋块（含有染色体）限制性酶切后电泳第44页，课件共77页，创作于2023年2月