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宏基因组技术在植物促生菌发掘中的研究进展

摘要:常用的生物农业和其他生物化学制剂产品中的各种微生物生殖素材主要含义是一种植物中的根际生殖促生菌(plantgrowthpromotingrhizobacteria,pgpr),定殖菌的区域主要含义应该指的是一种植物的整个根际生殖体系,并且要切除那些认为可以直接促使其他植物根芽生长和根部发育的一类寄生细菌。但是由于我国土壤中绝大多数的土壤微生物都无法被有效培育和综合利用,从而严重地直接限制了土壤微生物在我国土壤资源中的有效开发和综合利用,宏基因组分析技术已经完全可以彻底破除这一技术困境,成为当前我国推进微生物土壤资源综合开发的一种重要手段。闹述了基于土壤中的宏基因组筛选文库的基本结构、土壤中的宏基因组筛选文库的基本性质和应用特点及其在有效筛选同类文库时所可能取得的一些重要收获,并重点突出分析了如何有效构建基于土壤中的宏基因组筛选文库所可能存在的一些主要问题。

关键词:土壤,宏基因组技术;土壤宏基因组文库;

1.引言

土壤作物中的多种微生物营养资源丰富,据科学估计1g的颗粒土壤大约可以含有4000~7000种近10亿的多种微生物和多种细菌,其中微生物资源总产能最高密度可达300~300o0kg/hm。常规的对于培养微生物纯化和培养的研究技术主要包括了具有对于培养样品原料进行综合采取,微生物原料进行综合分离,大量的综合培养,培育物的大量收集和综合获得,目标物的抽提,鉴定,目标物的研究开发和综合利用。此种方法尽管能够在体内获得一种新的化学物质,但其前提条件还需要从所有可以培养的细菌中进行筛选。据统计,在土壤中无法培养的微生物约为99.7%例,而大部分的土壤微生物不能被培养的主要原因:一个问题就是任何种子的培养基都无法完全地再现土壤中各种微生物在其自然界中的生存环境,有些土壤中的微生物需要以特定的方法排列一定时间才会具备有活性,单独进行微生物培养就会出现无法具备活性,二个问题就是由于现代培养工艺和技术的限制,致使大批量培养。未经培养的微生物就无法被人们发现,这就极大地限制了对微生物资源的综合开发和利用。宏基因组技术回归方式避开了传统的土壤微生物分离培养的方法从特殊环境下的样品中进行提取原始dna,切割形成一定规模长度的dna片断并将载体相互连接,转入原始寄存在宿主细胞,构建完整的土壤宏基因组文库,然后进行筛选到确定目的基因。此种技术已经避开了传统的微生物分离和培养土壤利用方法,成为了开发各种不可再培养的土壤利用微生物资源的一种新途径。

图1宏基因组一般流程

2宏基因组学

宏基因组是一种泛指在环境中所有的可培养和不能被可培养的全部微生物基因组数量的总和,宏基因组文库技术有限度地避开了传统的微生物单独培养方法所带来的技术瓶颈,是科学家研究和整合利用各种微生物、特别是不能被可培养的微生物资源时最好的方法。近年来,随着dna测序技术、外源性基因表达技术的进步与发展,以及人们对自然产物的生物化学合成作用机制的重视与认识,利用宏基因组技术从未培养的微生物资源中获得生物活性的化合物及催化机制新颖的酶的研究取得了巨大的进展1~]。宏基因组的研究对象大多为土壤、水体,此外,各种特殊生境如热泉、海洋沉积物、动植物等也倍受关注l6-10]。植物无论说它是-粒的植物种子或者是一棵棵的参天大树,都通常应该认为是一个地区有着相对复杂的自然生态环境,不同的植物种类及其丰富程度高的微生物种类都会在此栖息其中。无论它们之间是真实生活在寄主植物的细胞体表上还是在植物组织内部,也无论它们之间与共生寄主植物之间的相互关系怎样,这些共生寄主植物都不是可以被人们统一地称为寄主植物之间共生的细菌(plantmicrobiota)[。尽管对可培养的植物共生菌已有不少研究,但对未可培养的植物共生菌资源却知之甚少。前期的研究中,我们首先打开了突破传统植物共生菌丰富集化的科学技术瓶颈,创建了独特的一种关于植物共生菌丰富集化的方法,并在此基础上成功地构建了全球范围内第一个植物共生菌宏基因组文库[7。

目前,主要通过基于功能(Function-basedscreening)和基于序列(Sequence-basedscreening)的筛选方法进行宏基因组文库的筛选[。不过,筛选方法一直是宏基因组基因资源开发利用的技术软肋,现有的筛选方法都存在明显的局限性,或者适用范围太窄,或者难以实现高通量筛选,或因成本太高而难以推广。此外,由于宏基因组在临床研究中的绝大多数有机体和植株微生物目前仍然远远无法完全获得单独的纯培育。在纯培养技术短期内难以取得突破性进展的状况下,对这些微生物的基因资源及化合物资源进行深入的研究在很多时候仍然是在碰运气。虽然宏基因组的深人研究还存在许多障碍,却阻挡不了研究者们进入这一领域的热情。