动物及其加工产品中转基因成分PCR筛查方法.docx

SN/T3494—2013

动物及其加工产品中转基因成分PCR筛查方法

1范围

本标准规定了动物及其加工产品中转基因成分PCR检测方法。

本标准适用于动物及其加工产品中转基因成分筛查检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T20190饲料中牛羊源性成分的定性检测定性聚合醇链反应(PCR)法

GB/T21101动物源性饲料中猪源性成分定性检测方法PCR方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

转基因transgeme

将本物种不具有的，来源于其他物种的功能DNA序列，通过各种导入手段，使其在该物种中进行表达，以便使该物种龚得新的品种特征。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

bp碱基对(basepair)。

CMV启动子：人巨细胞病毒(humaneytomegaloviruspromoter)。

dATP;脱氧腺苷三磷酸(deoxyadenosinetriphosphate)。

dCTP;脱氧胞苷三磷酸(deoxyeyticinetriphosphate),

dGTP;脱氧鸟苷三磷酸(dcoxyguanosinetriphosphate)。

dNTP;脱氧核苷三磷酸(deoxyribonucleosidetriphosphate)。

dTTP?脱氧胸苷三磷酸(deoxythymidinetriphosphate)。

DNA?脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)。

GFP?绿色荧光蛋白(greenfluarescentprotein)。

NPTⅡ:新霉素-8-磷酸转移酶基因(neomycin-3-phosphotransferasegene)。

SV40:棘猴空泡病毒40(SimianVacuolatingvirus40)。

Tag酶：DNA聚合酶。

TE:Tris-HCI,EDTA缓冲液。

SN/T3494—2013

Tris:三(羟甲基)氨基甲烷[tris(hydroxymethyDaminomethane]。

5试剂

5.1PCR用引物

内参照基因引物设计参照GB/T20190和GB/T21101,外源基因引物设计见表1(序列参见附录A,相关文献参见附录B)。将合成的引物加入无离子水配成100pmol/gL贮存，配成直接用于PCR反应的10pmol/pl.的工作液。

表1检测转基因动物内外基因所需的引物序列

被检测基因

基因来源

引物序列

扩增长度/bp

备注

猪线粒体基因

内源

5*-GCCTAAATCTCCCCTCAATGGTA-35°-ATGAAAGAGGCAAATAGATTTTCG-3

212

内对照

牛线税体基因

内源

S-GCCATATACTCTCCTTGGTGACA-3

5*-GTAGGCTGGGGAATAGTACGA-3

271

内对照

羊线粒体基因

内源

51-TATTAGGCCTCCCCCTTGTT-3*F-CCCTGCTCATAAGGGAATAGCC-3

294(山羊》295(绵羊)

内对照

NPTⅡ

外源

5*-CTATTCGGCTATGACTGG-35-TGAGATGACAGGAGATCC-3

263

薛查检测

CMV启动子

外源

G*-GTCATTAGTTCATAGCCATA-35*-GCGGAGTTGTTACGACATTT-3

483

筛查检测

SV40PolyA

外源

S*-TGTTTATTGCAGCTTATAATGG-3S-ACAAACCACAACTAGAATGC-3

96

筛查检测

GFP

外源

5*-TTCTTCAAGTCCGCCATG-35GTGTTETGCTGGTAGTGG-3”

311

薛查检测

5.2药品及试剂

TayDNA聚合酶，琼脂糖(电泳纯)。三氯甲烷(氯仿),异丙醇，异皮障.70%乙醇，分子量标准

(100bp~2000bp),TE缓冲液，50倍TAE电体浓缩缓冲液，动物组织裂解缓冲洁，蛋白酶K,醋酸钠

(NaAc)。试剂配制见附录C。

6仪器

6.1PCR仪。

6.2