动物炭疽诊断技术.docx

1

NY/T561—2002

动物炭疽诊断技术

1范围

本标准规定了动物炭疽杆菌分离培养鉴定及血清学试验方法。

本标准适用于各种动物炭疽病的诊断及检疫。

2新鲜疑似炭疽病料标本的细菌学检查

2.1显微镜检查

2.1.1材料准备

2.1.1.1器材

恒温箱、显微镜、高压灭菌器、煮沸消毒器、漏斗、15mm×150mm试管、最小反应管、移液管、带胶乳头的毛细吸管(或血清加样器)、乳钵、中性石棉、5mL注射器、外科刀、镊、铂金耳、酒精灯等。

2.1.1.2培养基

戊烷脒多粘菌素血液琼脂平板、碳酸氢钠琼脂平板、快速增殖肉汤、普通营养肉汤、普通营养琼脂平板、2%绵羊血液琼脂平板、2%兔血清琼脂平板等，配制方法见附录A。

2.1.1.3试剂

炭疽沉淀素血清、阴性血清、标准炭疽杆菌抗原、炭疽荧光抗体、炭疽噬菌体。

2.1.1.4溶液及染色液

克氏固定液、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、缓冲甘油、0.5%苯酚(俗名石炭酸)溶液、福尔马林龙胆紫染色液、碱性美蓝染色液、革兰氏染色液，配方见附录B。

2.1.1.5实验动物

体重17g～20g清洁级昆明系小鼠。

2.1.2病料标本采集

疑为炭疽动物，除慢性者外，其他不论是最急性者或急性者均于生前将耳部消毒后取血液，病变部取水肿液或渗出液等直接涂于载玻片上，自然干燥后，将玻片涂面相对叠好，中间用火柴杆隔开，以线捆扎，外用塑料纸包好。或用灭菌脱脂棉、滤纸、布片吸取血液等放于小试管中，待检。

死后，自消毒的耳根部或四肢末端部采取血液滴于玻片上；或用细绳在耳根部紧扎两道，在两绳之间将耳割下，以5%苯酚溶液(见第B.8章)浸湿的棉布包好，放广口瓶中待检，耳切口处用烧红的烙铁烧灼止血。已经错剖的疑似炭疽动物尸体，可取肝、脾、肾等脏器置于试管中，待检。

上述涂片自然干燥，火焰固定，如涂片较薄，也可用无水甲醇或乙醇固定，然后用下述染色法染色镜检。

2.1.3雷比格尔(Rabiger)氏荚膜染色法

2.1.3.1操作方法

滴加0.5mL～1.0mL福尔马林龙胆紫染色液(见第B.5章)于涂抹面上，染色2s～5s,水洗(冲洗

水用次氯酸盐溶液消毒，余同)、干燥、镜检。

2.1.3.2结果观察

粗大菌体呈竹节状排列，染成深紫色，菌体周围的荚膜染成淡紫色。

2

NY/T561—2002

2.1.4碱性美蓝染色法

2.1.4.1操作方法

滴加0.5mL～1.0mL碱性美蓝染色液(见第B.6章)于涂抹面上，染色2min～3min,水洗、干燥、

镜检。

2.1.4.2结果观察

粗大菌体呈竹节状排列，染成深蓝色，菌体周围的荚膜染成粉红色。也可用3%沙黄染色液染色3min～5min,菌体染成红色，菌体周围的荚膜染成黄色。

如观察到以上形态特征的杆菌，可初步确定为炭疽杆菌。

2.1.5荧光抗体染色法

2.1.5.1取样，涂片

以无菌手续采取可疑病变组织、水肿液、血液或渗出液等材料制成涂片标本，待检。

2.1.5.2染色方法

染色方法如下：

a)将制备好的涂抹玻片，自然干燥。

b)将玻片投人克氏固定液内，固定15min,再经95%酒精略加漂洗，自然干燥。

c)滴加炭疽荧光抗体血清(见2.1.1.3)0.5mL～1.0mL浸没涂片，放湿盒内，室温孵育

20min～30min。

d)用磷酸盐缓冲盐水(PBS)(见第B.2章)冲去荧光抗体，并于同一磷酸盐缓冲盐水内浸泡

3min～5min,再经蒸馏水略加漂洗，自然干燥。

e)加适量缓冲甘油(见第B.3章),封片，荧光显微镜检查。

2.1.5.3检查结果

H:菌体周围的荚膜肥厚，发闪亮的黄绿色荧光，中央菌体呈明显或不明显的橙红色。

卅：菌体周围的荚膜肥厚，发明亮的黄绿色荧光，中央菌体呈明显或不明显的橙红色。+:菌体周围的荚膜肥厚，发较弱的黄绿色荧光，中央菌体呈明显或不明显的橙红色。+:荚膜不显著,黄绿色荧光暗淡，中央菌体呈明显或不明显的橙红色。

一：无黄绿色荧光。

荧光反应在“+”号以上者，报告发现了炭疽杆菌。

2.2分离培养检查

炭疽杆菌的培养性状具有特征性，是确诊的重要依据之一，但病畜病程短，故分离培养检查主要用于动物死后新鲜标本的检验。

2.2.1操作方法

用铂金耳钓取血液、水肿液、渗出物等，直接涂于平板培养基表面；脏器标本应切成几个不同的断面，压印于平板表面上，置37℃恒温箱中孵育