细胞培养常见问题之血清篇.docx

细胞培养是指在人工创造的与体内生长环境相似，如无菌条件、适宜的温度、pH、CO2环境和适宜营养条件下，使细胞生长、繁殖并维持主要结构和功能的技术。

细胞培养是细胞生物学研究方法中最常用也是最重要的技术之一，在现代医学、生物科学、农业科学等领域被广泛应用以提供研究模型和实验材料。在细胞培养过程中，完全培养基对细胞生长状态起到关键作用，决定实验成功与否。而血清是完全培养基中的关键成分之一，除为细胞生长提供基本营养物质、结合蛋白、一些参与解毒代谢的微量元素和可起到中和保护的酶类之外，还可以保护细胞免受机械损伤，因此被业内认为是细胞增殖过程中最重要的试剂。在生命科学领域的细胞培养技术中，动物血清的应用十分广泛，特别是牛来源血清。而牛源血清又分为胎牛血清、新生牛血清和小牛血清，它们的区别方式主要由于牛龄和采血方式不同，其中胎牛血清因其抗体水平含量低对后续实验结果影响小、生长因子含量水平高利于细胞增殖而应用最广。因此关注胎牛血清的品级、质量以及使用过程的一些注意事项，会对实验结果起到直接影响作用，并可以确保科研人员在实验操作过程中的安全性。

今天我们就来看看在细胞培养过程中血清使用方面常见的问题，如：血清储存条件、如何程序解冻、细胞污染与血清之间的关系、传说中的“黑胶虫”是什么以及血清热灭活是否有必要等等，“工欲善其事，必先利其器”，通过今天的解析与学习可以让我们在做细胞培养相关实验时事半功倍！那我们就开始吧~

Q1：血清长期储存的条件和方法是什么？

A1：血清如需长期保存，则必须储存于-10℃或更低温冰箱中，建议存放于-20℃的冰箱中。研究表明储存在-80℃条件下的血清在性能方面变化不大，但由于解冻时温差过大，会导致析出更多沉淀，使得背景杂乱，因此血清长期保存不建议处于-80℃条件下。如果近期会频繁使用血清，我们建议不要在4℃条件下存放超过1个月，若一次无法用完整瓶建议分装后保存，且要避免反复冻融。另外，血清冰冻后体积会增加约10%，因此血清分装时请留意预留一定的体积空间。

Q2：如何进行血清的程序性解冻？血清才不会使产品质量受损？

A2：程序性解冻血清可以确保血清制品质量的稳定性，且不会因为温差过大而析出过多蛋白等沉淀。程序性解冻方法是于实验开始之前将冷冻的血清置于4℃冰箱中融解，并且在解冻过程中每隔1小时摇匀一次，使温度与成分均一，减少沉淀析出，直至全部解冻，然后再移入室温条件下使用。

Q3：血清解冻后发现絮状沉淀该如何处理？

A3：造成血清发生絮状沉淀的原因主要是血清解冻过程中温差带来了脂蛋白变性和纤维蛋白析出，沉淀本身不会影响血清质量，也不会对实验结果造成影响。但如必须处理沉淀，则可通过离心方式去除，如500-1000×g离心5-10min。

Q4：血清沉淀是什么？

A4：用于细胞培养的胎牛血清及其他血类制品中均存在各种类型的沉淀，如纤维蛋白和磷酸钙等。一些絮状沉淀主要就是纤维蛋白，通常我们肉眼可见，大小在1-2mm之间；而磷酸钙在显微镜下观察呈现布朗运动的小黑点，通常被误认为是微生物污染。血清沉淀往往比较难以预测和控制，但幸运的是这些沉淀不会影响血清品质。

Q5：血清中的小黑点是“黑胶虫”么？

A5：血清解冻过程温差过大、经反复冻融或通过热灭活处理后更容易产生沉淀，这些沉淀物在镜下观察时有一些会呈现以布朗运动的小黑点，业内流行一种“黑胶虫”污染的说法，但“黑胶虫”一直以来都是极为神秘的存在，至今科学家们也没有完整的实验结果可以证实它究竟是一种生物还是非生物，更有人认为“黑胶虫”是血清的原虫，或误以为是细菌或真菌污染。但科学家通过进一步的研究发现它们更可能是血清中的蛋白结晶。这种结晶可能为蛋白析出，如纤维蛋白原凝结成纤维蛋白；或是盐析出，如磷酸钙等；也有一些是胆固醇和脂肪酸。以下图片就证实了这一说法，如纤维蛋白和磷酸钙。

图1：上图分别为纤维蛋白在低倍镜和高倍镜下观察到的图像，下图为磷酸钙在低倍镜和高倍镜下观察到的图像（箭头指示的是我们看到的“黑点”）

Q6：如何判断血清污染？

A6：

（1）首先检查并判断外包装是否有破损，一般瓶身破损的血清发生污染的可能性极大；

（2）将血清接种到血酯板上，培养后看是否有菌落形成；

（3）可通过质量检测试剂盒检测结果判定，如支原体检测试剂盒等。血清污染主要包括细菌污染、真菌污染和支原体污染。在细胞培养时想要确定血清存在细菌污染，可尝试使用5-10倍浓度青链霉素双抗冲击培养24-48h；真菌污染的细胞无法抢救，应立即将细胞瓶进行高压灭菌处理，并彻底消毒培养箱；支原体污染可考虑更换早期代次细胞，或使用商品化支原体去除试剂。

Q7：细胞形态不正常、生长状态异常或增殖速率缓慢是否与血清有关？

A7：细胞形态异常需要综合关注细胞代次、传代操作、培养基和血清等诸多因素。如传代次数过多或