16 高效液相色谱法.ppt

1．分离原理：以固体吸附剂为固定相，根据其对不同组分吸附能力的差异进行混合物分离。表现在溶质分子占据固定相表面吸附活性中心能力的差异（分离前提：K不等或k不等）。2．固定相：固定相通常是活性硅胶、氧化铝、活性炭、聚乙烯、聚酰胺等固体吸附剂，所以吸附色谱也称液-固吸附色谱。活性硅胶最常用。3．流动相：弱极性有机溶剂或非极性溶剂与极性溶剂的混合物，如正构烷烃（己烷、戊烷、庚烷等）、二氯甲烷/甲醇、乙酸乙酯/乙腈等。4．影响k的因素：与固定相性质和流动相性质有关溶质分子极性↑，洗脱能力↓，k↑，tR↑溶剂系统极性↑，洗脱能力↑，k↓，tR↓注：调节溶剂极性，可以控制组分的保留时间5．出柱顺序：强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱应用：用于结构异构体分离和族分离仍是最有效的方法，如农药异构体分离、石油中烷、烯、芳烃的分离。缺点：容易产生不对称峰和拖尾现象。1．流动相具有低粘度和适当低的沸点。2．流动相与固定相不相溶。3．流动相对样品有足够的溶解能力。4．流动相与所使用的检测器相匹配。5．流动相应无显著毒性。等度洗脱：在同一分析周期内流动相的组成保持恒定。适用：组分数目少、性质差别不大的样品。梯度洗脱：在一个分析周期内，通过程序控制，连续改变流动相的组成，从而使流动相的强度、极性、pH值或离子强度相应地变化，达到提高分离度，缩短分析时间的目的。适用：组分数目多、性质差别大、k差异小的复杂样品。分析化学HPLC中的速率理论（与GC对比）GC:H=A+B/u+C·u(填充柱）或H=B/u+C·u(毛细管柱）HPLC:H=A+C·u一、速率理论仅与固定相粒度和柱填充的均匀度有关一、速率理论（一）涡流扩散项A由于组分分子在两相间的传质过程中不能瞬间达到平衡而引起，从而使色谱峰扩张，其含义与气相色谱法完全相同。则高效液相色谱法中的速率方程可以简写为：（三）传质阻力项C一、速率理论产生：柱外死体积引起的色谱峰展宽影响：柱外死体积解决：各部件接头采用“零死体积接头”管道对接呈流线型检测器流通池采用尽可能小的池体积分析化学检测器高压输液泵高压输液泵输液泵进样器色谱柱检测器色谱工作站液相色谱仪的关键部件，其作用是将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱系统。输液泵的稳定性直接关系到分析结果的重复性和准确性。（一）高压输液泵（二）梯度洗脱装置高压梯度：由两个输液泵分别各吸入一种溶剂，加压后再混合，混合比由一个泵的速度决定。低压梯度：用比例阀将多种溶剂按比例混合后，再由输液泵加压输送至色谱柱。色谱柱色谱柱泵泵12进样六通进样阀：色谱柱：是实现分离的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能稳定。柱性能与柱结构、填料特性、填充质量和使用条件有关。保护柱：是接在分析柱前端的装有与分析柱相同固定相的短柱（5nm～20nm），可以经常更换。四、色谱柱用来连续监测经色谱柱分离后的流出物的组成和含量变化的装置。紫外检测器荧光检测器示差折光检测器电化学检测器蒸发光散射检测器特点：灵敏度高；线形范围高；流通池可做的很小；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。浓度型检测器，应用最广，对大部分有机化合物有响应（一）紫外检测器许多有机化合物，特别是芳香族化合物、被一定强度和波长的紫外光照射后，发射出较激发光波长要长的荧光。?特点：具有高的灵敏度和选择性的浓度型检测器，灵敏度要比紫外检测法高2?3个数量级，特别适合于药物和生物化学样品的分析。（二）荧光检测器利用样品池和参比池之间折光率的差别而对组分进行检测，测得折光率差值与组分浓度成正比。缺点：折光率受温度影响较大，检测灵敏度低，不能用于梯度洗脱。（三）示差折光检测器（四）电化学检测器利用组分在氧化还原过程中产生的电流或电压变化而对样品进行检测。特点：只适用于测定具有氧化还原活性的物质，灵敏度较高。适合于无紫外吸收、无电活性和不发荧光的样品的检测。不适于挥发性物质，特别适于梯度洗脱。1．检查仪器各部件的电源线、数据线、输液管等是否连接正常。2．流动相用滤膜过滤、超声脱气。3．待输液泵