免疫细胞及其功能检验技术.ppt

第二节淋巴细胞数量及功能检测常用于鉴定和检测淋巴细胞表面标志是簇分化抗原（Clusterofdifferentiation，CD）。细胞表面分化抗原（CD抗原）适用于T、B细胞的分离已知CD抗原细胞亚群的分离未知CD抗原细胞亚群的分离（阴性分选）一、T细胞表面标志及其亚群CD3+CD4+CD8-辅助性T细胞（helpTcell,Th）CD3+CD4-CD8+细胞毒性T细胞（cytotoxicTcell,TcorCTL）CD4+CD25+调节性T细胞（regulatoryTcell,TrorTreg）二、T细胞功能的检测T细胞增殖试验T细胞分泌功能测定T细胞介导的细胞毒试验体内试验（一）T淋巴细胞增殖试验1.原理：淋巴细胞DNA合成分化母细胞刺激物细胞变大细胞浆扩大空泡核仁明显核染色质疏松未转化和转化淋巴细胞的形态特征转化的淋巴细胞未转化的淋巴细胞淋巴母细胞过渡型细胞大小(直径μm)12～2012～166～8核大小、染色质增大、疏松增大、疏松不增大、密集核仁清晰、1～4个有或无无有丝分裂有或无无无胞质、着色增多、嗜碱增多、嗜碱极少、天青色浆内空泡有或无有或无无伪足有或无有或无无2.淋巴细胞转化的刺激物非特异性刺激物：PHA------T细胞ConA-------T细胞PWM-------T、B细胞LPS-------B细胞特异性刺激物：异种抗原同种组织抗原3.检测方法形态法：刺激物淋巴细胞（4-6天）母细胞化同位素法：PHA淋巴细胞（54h）DNA合成期+3HTdR掺入收集细胞?检测β射线测定细胞内的3H－TdR（1）形态学检查法方法学评价：优点：形态学方法简便易行，普通光学显微镜便能观察结果，适于基层实验室应用。缺点：是依靠肉眼观察形态学变化，判断结果易受主观因素影响，重复性和准确性较差。（2）3H-TdR掺入法优点：3H-TdR掺入法敏感性高，客观性强，重复性好。缺点：但需一定设备条件，同时还存在放射性核素污染问题。(二)T细胞分泌功能测定体外培养的T细胞经各种丝裂原或抗原刺激后,分泌各种细胞因子,可借助免疫学、细胞生物学及分子生物学技术分别检测细胞因子含量、生物学活性或基因表达水平，以反映T细胞功能。（三）T细胞介导的细胞毒试验1.原理：靶细胞抗原T细胞观察杀伤活力致敏CTL靶细胞形态学方法：淋巴细胞+肿瘤细胞计数残留肿瘤细胞同位素法：淋巴细胞（CTL）+含51Cr的肿瘤细胞肿瘤细胞破坏51Cr释放测定γ射线2.方法意义：肿瘤患者CTL杀伤肿瘤细胞的能力图15-2T细胞细胞毒试验示意图(四)体内试验特异性抗原皮肤试验PHA皮肤试验三、B细胞表面标志SmIg、Fc受体、补体受体、EB病毒受体，部分CD分子是B细胞的重要表面标志，其中以SmIg为B细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指标。CD19/CD5分子：可将B细胞区分为B1细胞和B2细胞，B1细胞为CD19和CD5双阳性，而B2细胞仅为CD19阳性，B2细胞为通常所指的B细胞。二、B细胞功能检测B细胞增殖能力的试验溶血空斑试验B细胞抗体形成功能的检测体内试验(一)B细胞增殖能力的试验抗IgM细菌脂多糖SAC的SPA B细胞增殖形态学3H－TdR掺入法(二)溶血空斑试验1.原理：2.方法学：经典溶血空斑形成试验被动溶血空斑试验3．临床应用与评价溶血空斑试验主要用于测定药物和手术等因素对体液免疫功能的影响评价免疫治疗或免疫重建后机体产生抗体的能力。(三)B细胞抗体形成功能的检测

——酶联免疫斑点法1.原理：2．应用与方法学评价：该方法既可检测抗体分泌细胞，又可检测抗体分泌量。优点：稳定、特异、抗原用量少；可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定量；可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。