多糖含量的测定.pdf

多糖含量的测定

1.原理

分子量大于10，000道尔顿的多糖经80%乙醇沉淀后，加入碱性铜试剂，选择性地

从其他高分子物质中沉淀出葡聚糖，沉淀部分与苯酚-H2SO4反应，生成有色物质，在

485nm条件下，有色物质的吸光度值与葡聚糖浓度成正比。

2.适用范围

参照AOAC方法。适用于检测含有分子量大于10，000道尔顿葡聚糖的样品。

3.仪器

（1）分光光度计

（2）离心机

（3）旋转混匀器

（4）恒温水浴锅

4.试剂

除特殊说明外，实验用水为蒸馏水，试剂为分析纯。

（1）80%乙醇：800ml无水乙醇加水200ml。

（2）2.5mol/LNaOH溶液：100gNaOH加蒸馏水稀释至1L，加入固体无水硫酸钠

至饱和。

（3）铜贮存液：称取3.0gCuSO4·5HO，30.0g柠檬酸钠加水溶解至1L。溶液可贮

2

存2周。

（4）铜应用溶液：取铜贮存液50ml，加水50ml混匀后加入无水硫酸钠12.5g，临

用新配。

（5）洗涤液：取水50ml，加入10ml铜应用溶液，10ml2.5mol/LNaOH溶液，混

匀。

（6）1.8mol/LHSO：取100ml浓硫酸用水稀释至1L。

24

（7）20g/L苯酚溶液：称取2.0g苯酚，加水溶解并稀释至100ml，混匀备用。

（8）葡聚糖标准液：称取500mg葡聚糖（分子量500,000D）于称量皿中，105℃

干燥4h至恒重，置于装有干燥硅胶的干燥器中冷却。准确称取100mg干燥后的葡聚糖，

用水定容至100ml，葡聚糖标准浓度为1.0mg/ml。

（9）葡聚糖标准应用液：吸取葡聚糖标准液10ml，用水稀释10倍，葡聚糖终浓度

为0.1mg/ml。

5.操作方法

5.1样品处理

（1）样品提取：称取样品1～5g，加水100ml，沸水浴加热2h，冷却至室温，定容

至200ml（V1），混匀后过滤，弃初滤液，收集余下滤液。

（2）沉淀高分子物质：准确吸取上述滤液100ml（V2），置于烧杯中，加热浓缩至

10ml，冷却后，加入无水乙醇40ml，将溶液转至离心管中以3000rpm离心5min，弃上

清液，残渣用80%乙醇洗涤3次，残渣供沉淀葡聚糖之用。

（3）沉淀葡聚糖：上述残渣用水溶解，并定容至50ml（V3），混匀后过滤，弃初始

滤液后，取滤液2.0ml（V4），加入2.5mol/LNaOH2.0ml，Cu应用溶液2.0ml，沸水浴

中煮沸2mim，冷却后以3000rpm离心5min，弃上清液，残渣用洗涤液洗涤3次，残渣

供测定葡聚糖之用。

（4）测定葡聚糖：上述残渣用2.0mL1.8mol/LHSO溶解，用水定容至100mL（V5）。

24

准确吸取2.0ml（V6），置于25ml比色管中，加入1.0ml苯酚溶液，10ml浓硫酸，沸水

浴煮沸2分钟，冷却比色。从标准曲线上查得相应含量，计算粗多糖含量。

5.2标准曲线制备：

精密吸取葡聚糖标准应用液0.10，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00，1.50，2.00ml

（分别相当于葡聚糖0.01，0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.15，0.20mg），补充水至

2.0mL，加入苯酚溶液1.0ml，浓硫酸10ml，混匀，沸水浴2分钟，混匀，沸水浴2分钟，

冷却后用分光光度计在485nm波长处以试剂空白溶液为参比，测定吸光度值（A），以葡

聚糖浓度为横坐标，A为纵坐标绘制标准曲线。

6.计算

从标准曲线上查得样品相应含量，计算粗多糖含量。

葡聚糖（%）=c×V5×V3×V1×0.1/V6×V4×V2×m=c×250/m……………

公式中：c--从标准