蛋白质样品的制备.ppt

一、裂解液

在蛋白质组学研究中，蛋白质裂解是一个重要的环节。蛋白质间的分开与疏远程度关系到双向电泳的分离效果。选择适宜的裂解剂能够实现蛋白质间的良好分离，是提高双向电泳分离效果的一个有力措施。⑴离液剂尿素是常用的离液剂，它的主要作用是改变或破坏氢键等次级键的结构，使得蛋白变性并使蛋白酶失活。尿素作为一种中性的离液剂，通常在裂解液中的浓度为8mol/L。尿素可溶解和解折叠大多数的蛋白质，形成完全随机的构象，使所有的离子基团暴露于溶液中。近来硫脲的加入可以进一步提高溶解度，特别是膜蛋白。在实际应用中，需要高溶解强度时，一般用2mol/L硫脲和5-8mol/L的尿素联合使用。第31页,共56页，2024年2月25日，星期天⑵还原剂还原剂主要是用来断裂蛋白分子中Cys残基之间形成的二硫键，增加蛋白的溶解性。通常用的还原剂有β-巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）或二硫赤藓糖醇（DTE)和三丁基膦（TBP）,目前常用的是DTT。第32页,共56页，2024年2月25日，星期天⑶去污剂（表面活性剂）去污剂主要是通过破坏蛋白之间的疏水相互作用，以确保蛋白完全溶解和防止通过疏水相互作用导致蛋白聚合。去污剂有离子型、非离子型和兼性离子型等几类。经常使用的有阴离子去污剂SDS，非离子去污剂NP-40和TritonX-100，两性离子去污剂CHAPS。原则上去污剂应该是非离子型或者是兼性离子型，这样才不会影响蛋白质的迁移位置。最初，两个相似的非离子去污剂NP-40和TritonX-100被广泛应用。随后研究表明：兼性离子去污剂CHAPS的效果更好。第33页,共56页，2024年2月25日，星期天二、裂解技术⑴裂解液的组成裂解液基本成分包括：脲、一种或几种去污剂（还原剂、固相PH梯度缓冲液也可以增强样品的溶解性）脲：可溶解和折叠大多数的蛋白质，形成完全随机的构象，使所有的离子基团暴露于溶液中（硫脲的加入可以进一步提高溶解度，特别是对膜蛋白）去污剂：确保蛋白完全溶解和防止通过疏水相互作用导致蛋白质聚合还原剂：可以断裂二硫键，以保持蛋白处于一种还原状态。载体两性电解质和固相PH梯度缓冲液也包含于裂解液中：通过电荷与电荷之间的相互作用减少蛋白质聚合来增强其溶解性。第34页,共56页，2024年2月25日，星期天⑵裂解策略对每一种样品而言，适宜的裂解步骤可由经验而定，其目的均是尽可能地完全溶解、解离、变性和还原蛋白质。第35页,共56页，2024年2月25日，星期天通常可以用细胞或组织中的全蛋白组分进行蛋白质的分析，也可以进行样品的分级、即采用各种方法将细胞或组织中的全蛋白分成几部分，分别进行蛋白质组的研究。样品预分级的主要方法包括根据蛋白质的溶解性和蛋白质在细胞中不同的细胞器定位进行分级，如专门分离出细胞核、核糖体、细菌细胞壁、叶绿体、线粒体等的蛋白质成分。样品预分级不仅可以提高低丰度蛋白质的上样量和检测，还可以针对某一细胞器的蛋白质组进行分析。第四节样品预分级第36页,共56页，2024年2月25日，星期天一、亚细胞器的分离主要是利用细胞内各种颗粒大小、形状和密度不同，在不同离心力场下进行差速离心或在不同密度下进行密度梯度离心，从而获得不同亚细胞器组分。㈠细胞匀浆取待分析的组织细胞样品以0.9％NaCl溶液反复清洗，加入SE缓冲液（0.25mol/L蔗糖、1mmol/LEDTA)，在低温下研磨成匀浆备用。第37页,共56页，2024年2月25日，星期天㈡亚细胞器的差速离心及密度梯度离心分离1.差速离心指在密度均一的介质中不同大小的颗粒通过在不同离心力场的作用下沉降而分离。2.密度梯度离心指用一定的介质在离心管中形成连续或不连续的梯度，将细胞混悬液置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层分离。⑴速度沉降分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器，其原理是生物颗粒在密度梯度介质中按各自的沉降系数以不同的速度沉降。⑵等密度沉降平衡适用于分离密度不等的颗粒。细胞或细胞器在连续梯度的介质中经足够大的离心力和足够长时间沉降或漂浮到与自身密度相等的介质中，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的细胞或细胞器分离。第38页,共56页，2024年2月25日，星期天二、细胞的分离临床样品都是各种细胞或组织混杂，而且状态不一。如肿瘤组织中，发生癌变的往往是上皮类细胞，而这类细胞在肿瘤中总是与血管、基质细胞等混杂。所以常采用癌和癌旁组织或肿瘤与正常