蛋白质的分离纯化.ppt

聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）不连续：浓缩胶和分离胶电泳迁移率决定于所带的净电荷以及分子大小和形状等因素。+凝胶加样P309第31页,共42页，2024年2月25日，星期天巯基乙醇：打开二硫键。SDS：变性剂，破裂蛋白质分子中的氢键和疏水作用。SDS以其氢键与蛋白质分子的侧链结合成复合体。①带有很多负电荷——远远超过蛋白质分子原有电荷②改变了蛋白质单体分子的构象：近似雪茄烟形的长椭圆棒，短轴长度相同，长轴长度随蛋白质的相对分子质量成正比例变化。迁移率主要取决于蛋白质相对分子量SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）第32页,共42页，2024年2月25日，星期天第33页,共42页，2024年2月25日，星期天迁移率第34页,共42页，2024年2月25日，星期天4.2等电聚焦电泳高分辨率的蛋白质分离技术。在具有pH梯度的介质中进行的。在外电场的作用下各种蛋白质将移向并聚焦（停留）在等于其等电点的pH梯度处，并形成一个很窄的区带。特别适用于同功酶的鉴定。只要它们的pI有0.02pH单位的差别就能分开。P310第35页,共42页，2024年2月25日，星期天第36页,共42页，2024年2月25日，星期天等电聚焦电泳电泳时，每种蛋白迁移至与它的pI相一致的pH处加入蛋白样品电场作用下在凝胶中建立稳定的一个pH梯度第37页,共42页，2024年2月25日，星期天第38页,共42页，2024年2月25日，星期天等电聚焦电泳+SDS-PAGE第一向进行等电聚焦，蛋白质沿pH梯度分离至各自的等电点；再沿垂直的方向进行分子量的分离.4.3双向电泳pI降低分子量减小第39页,共42页，2024年2月25日，星期天两性电解质溶液等电聚焦电泳第40页,共42页，2024年2月25日，星期天SDS-PAGE第41页,共42页，2024年2月25日，星期天感谢大家观看第42页,共42页，2024年2月25日，星期天**层析法也称色谱法，是1906年俄国植物学家MichaelTswett发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法”层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。********关于蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化透析和超过滤超速离心层析（色谱）(chromatography)电泳(electrophoresis)第2页,共42页，2024年2月25日，星期天1透析和超过滤P302第3页,共42页，2024年2月25日，星期天2超速离心P302第4页,共42页，2024年2月25日，星期天基本原理：层析由流动相和固定相组成样品作为流动相流过固定相各组分在两相中分布程度不同各成分迁移率不同分离3层析（色谱）（Chromatography）P148第5页,共42页，2024年2月25日，星期天两相：固定相（静相）和流动相（动相）有效分配系数：第6页,共42页，2024年2月25日，星期天层析按流动相：气相、液相色谱等；按操作形式不同：纸层析、薄层层析、柱层析等；按分离机制：凝胶层析、离子交换层析、亲和层析、吸附层析等。第7页,共42页，2024年2月25日，星期天3.1纸层析

（Filter-paperchromatography）相对迁移率P151第8页,共42页，2024年2月25日，星期天3.2薄层层析

（Thin-layerchromatography）P152第9页,共42页，2024年2月25日，星期天3.3柱层析第10页,共42页，2024年2月25日，星期天①凝胶过滤层析(分子排阻层析、分子筛层析）（Gel-filtrationchromatography）根据蛋白质分子大小不同来分离纯化蛋白质的一种方法。P303第11页,共42页，2024年2月25日，星期天介质：凝胶颗粒（多孔的网状结构）交联度或孔度（网孔大小）——凝胶的分级分离范围交联葡聚糖——SephadexG-50（1500-30000）琼脂糖——Sepharose或Bio-GelA聚丙烯酰胺—