斑点杂交测乙肝病毒核酸课件.pptVIP

myszjpwd-myxr-xm斑点杂交测乙肝病毒核酸引言许多乙肝患者正遭受着慢性疾病的折磨,他们可能未曾意识到乙肝病毒还会传染给家人。一方面,实现乙肝疫苗预防接种可大大减少乙肝病毒的感染,另一方面只有通过早诊断、早治疗才能减少乙肝病毒载量,从而降低乙肝病毒的数量。这样不仅保护了患者的自身,还保护了他的家人。乙肝病毒DNA就是指脱氧核糖核酸,世界上任何生物都是依靠自身的DNA来复制后代的,乙肝病毒也是一样。HBVDNA侵犯人的肝细胞后,控制从复制、装备到释放病毒的全过程,HBVDNA阳性说明体内有活性病毒的复制。HBVDNA高复制就意味病情的稳定性可能比较差,传染性比较高。对HBVDNA的检测同时又有一个监测的意义。对HBVDNA的检测一般有两种,一实验原理具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下(适宜的温度和离子强度等)可按碱基互补的原则退火形成双链,此杂交过程是高度特异的.本实验杂交双方是待测核酸序列和探针,探针是已知的核酸片断(根据GeneBank公布的HBV序列,选择集保守性和可变性为一体的前C区作为核酸杂交探针),用地高辛标记,以利于随后的检测,待测核酸是从临床乙肝疑似病人血清中提取的DNA标本.二实验材料1标本疑似乙肝病人血清中提取的DNA.阴性对照血清中提取的DNA.2杂交试剂:20×SSC预杂交液.杂交液BufferⅠBufferⅡBufferⅢ(Roche公司提供)杂交试剂组成:(1)20×SSC:3MNaCl(175g/L),0.3M柠檬酸三钠2H2O(88g/L),用1MHCl调至PH7.0;(2)预杂交液:5×SSC,0.5﹪(w/v)封阻试剂,1﹪(w/v)N-十二烷酰基氨酸钠,0.02(w/v)SDS;(3)杂交液:在预杂交液中加入探针,浓度为2ng/μl;(4)BufferⅠ:100mMTris-HCl;150MmNaCl;pH7.5(20℃)(5)BufferⅡ:0.5﹪(w/v)封阻试剂配于BufferⅠ中三实验方法1、处理:将硝酸纤维素膜与20xSSC中浸泡1h,夹在两层滤纸中烘烤20～30min2、变性:将待测DNA样品与100℃水浴10min,立即置冰水中。(使DNA样品变性,即双链DNA→单链DNA)3、点样:将上述变性后的样品各2～4μl点在硝酸纤维素膜面上,室温下风干后,于烤箱80℃烘烤1～2h(使样品中DNA的与膜结合牢固)4、预杂交:将点样固定的杂交膜置于预杂交液中,60℃水浴摇床轻轻振摇30min～60min。(封闭杂交膜上多余的非特异性DNA结合位点)5、杂交液制备:用预杂交液将探针按2ng/μl浓度稀释,即为杂交液,100℃水浴5min变性。6、杂交:将杂交膜封入杂交袋中,加入杂交液2～3ml,除去气泡,封口。置于60℃恒温摇床上,轻轻振荡过。4℃可保存12h。),室温作用30min,经常摇动,使酶联抗体与地高辛结合。10、洗膜(洗去未结合的酶联抗体)(1)取出膜,将膜放入含有3～5mlBufferⅠ的培养皿中,洗膜两次,每次10～15min。(2)取出膜,将膜放入含有3～5mlBufferⅢ的培养皿平衡2～5min。11、显色:(1)将45μlNBTsolution和35μlX-Phosphate加入到10mlBufferⅢ中,显色液必须现配现用!(2)在10ml新鲜制备的显色底物液中静止避光显色数小时,常在12h内完成反应。