蛋白原核表达与纯化-(新生培训）.pptxVIP

MolecularMicrobiologyFoodSafetyLaboratory

蛋白的原核表达与纯化策略

ZHEJIANGUNIVERSITY

ChengCY2012-11-10

PartⅠ蛋白的原核表达

PartⅡ蛋白纯化

PartⅠ蛋白的原核表达

1 原核表达概述

2

原核表达策略选择

3 表达结果检测

4

常见问题与实验例

大肠杆菌(Escherichiacoli)

最通用的原核表达系统

遗传背景清楚，基因工程操作方便，商品化表达载体种类齐全，表达效率高；

基本不分泌，易形成包涵体(缺乏正确折叠的蛋白结

构)，无蛋白加工等修饰；

常见的原核表达载体： pET 系列 (T7 promoteNovagen公司)；pQE系列(T5 promoter，Qiagen公司)pGEX系列(GST融合表达，GE公司)；pBAD系列

(Arabinose诱导型)

目的基因扩增

目的基因插入表达载体

重组基因转化入宿主菌中

外源基因的表达

外源基因在大肠杆菌中表达流程

“基因——载体——菌株——培养”

系统名称

公司

启动子

抗性

常用标签 特点

pGEX

GE

tac

Amp

可溶性表达，纯化难以控制，

GST·Tag 谷胱甘肽一步洗脱，得到的

蛋白纯度较低,通常需要去掉

GST·Tag

pMal

NEB

tac

Amp

可溶性表达，纯化难以控制，

MBP·Tag 麦芽糖一步洗脱，得到的蛋白

纯度较低,通常需要去掉MBP·Tag

pET

Merck(Novagen)

T7 AmpT7lac Kan

His·Tag

种类丰富。标签小，无需切割，一般来说，对蛋白活性无影响。

纯化及其方便。

pEASY

Transgen

T7lac Amp His·Tag

同pET系统

常用原核表达载体系统

pET表达体系

pET系统最初由Studier及其同事构建(StudierandMoffatt,1986)，是有史以来在E.coli中克隆表达重组蛋白的功能最强大的系统；

目的基因被克隆到pET质粒上，受噬菌体T7强转录及翻译信号控制；表达有宿主细胞提供的T7RNA聚合酶诱导。

T7 RNA 聚合酶机制十分有效并具有选择性：充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白，诱导表达后仅几个小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%

以上。



pET各种表达体特性

T7lac启子:表达更加

T7启子

融合

常用于蛋白检测与纯化。

有时也可增加蛋白可溶性、将蛋白运转至特定位置。

考虑因素

细胞特性

蛋白稳定性

蛋白酶缺陷型——B型菌株，缺失lon、ompT蛋白酶

多种常用表达菌株均为此类，如BL21、Origami、Rosetta等

启动子

tac启动子需要大肠杆菌自身的RNA聚合酶即可：BL21

T7启动子需要能够提供T7RNA聚合酶的细胞：DE3溶源菌

抗性

细胞不能与载体带有相同的抗性：

pET-28a+OrigamiB(DE3) No！

pET-21b+OrigamiB(DE3) Yes！

严谨调控

BL21(DE3)pLysS/BL21(DE3)pLysE

稀有密码子

Rosetta系列

溶解性

Origami系列：Origami，OrigamiB和Rosetta-gami

稀有密码子：

不同生物使用密码子存在偏爱性。某种或某几种tRNA的缺乏，会导致外源目的基因的mRNA无法正常在E.coli里表达，是为“稀有”密码子。

表达菌株的

表达条件的化

常用表达条件的优化

培养基组分：葡萄糖会抑制

cAMP形成，进而抑制表达，严

谨调控，无其他严谨调控手段

重要

温度：影响表达速率、蛋白可溶性与活性

IPTG ： 浓度影响表达速

蛋白可溶性与活性

其他因素：培养基体积与通气

从中取出一些样品作为未诱导对照，在剩下的样品中加入 IPTG 至终浓度0.4

（（pLysS）且毒基因时，至关

mM（T7lac启动子），

T7启动子）或1

继续培养3-4小时；

菌体5000g，4℃离心。如果需要，收集上清进行进一步分析；

重悬细胞于1/10体积预冷的20mMTris-

HCl或50mMPBS（pH8.0）中离心；

除去上清，菌体保存于-70℃冰箱或继续

纯化。

常规的诱导条件

37℃摇床培养到OD600=0.4-0.1（建议OD600为0.6）约3-4小时可达到；

表达策略的

表达策略可溶表达包涵体

融合标签

天然蛋白

实验目的活性分析制备抗原高纯度结构研究

……

……

根据实验目的选择表达策略

选择表达载体

选择表达菌

优化表达条件

选择表达载体

系统名称

公司

启动子

抗性

常用标签

特点

pGEX

GE

(Pha