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组织细胞辅酶Ⅰ（NAD+/NADH）含量检测试剂盒(WST-8法)E2033
产品简介
NAD/NADH检测试剂盒（NAD/NADHAssayKit）是一种特异灵敏的检测总烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）或还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的试剂盒。NAD在细胞内以两种化学型存在，NAD+是氧化型，NADH是还原型。在氧化还原反应中，NAD+作为氢和电子的受体，NADH作为氢和电子的供体，在呼吸作用、光合作用、酒精代谢等生理过程中发挥重要作用。
本试剂盒利用NADH与CCK-8试剂反应生成NAD+和甲赞(Formazan)，通过测定甲赞450nm吸光度定量测定NADH浓度。在该检测反应中，同时加入乙醇和乙醇脱氢酶（ADH），可以将生成的NAD+还原为NADH，使检测反应成为循环反应，在乙醇、CCK-8和ADH过量的条件下，生成的甲赞与NAD+和NADH总量（NAD）成正相关，从而定量检测NAD浓度。在样本经过加热分解NAD+后，可以定量检测NADH浓度。
检测反应示意图如下：
本试剂盒具有良好的检测线性，检测NAD/NADH的线性范围为0.156-10μM，灵敏度≤0.156μM。
本试剂盒能够检测细胞培养上清、细胞裂解上清、组织裂解上清、血浆和血清中的NAD/NADH。
试剂盒组成
组份名称
规格
数量
储存
LysisBuffer
50ml/瓶
1
-20℃
NAD/NADHAssayBuffer
5ml/瓶
1
-20℃
EthanolSolution
250μl/管
1
-20℃
ADHSolution
250μl/管
1
-20℃
CCK-8Solution
1ml/管
1
-20℃
NADHStandard(1mM)
250μl/管
1
-80℃
储存条件
干冰运输，收到试剂盒后按将试剂盒不同组分按上述温度储存，有效期12个月。
注意事项
每次测定时利用标准品制作标准曲线。
实验过程中，除裂解液和检测缓冲液外，其它试剂请置于冰上。
3.本产品仅限专业人员用于科学研究，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。
测定前准备
1.样品的准备
细胞裂解上清的准备：将需要测定的细胞(1×106-1×107)收集到2ml的离心管中，4℃、300g离心5分钟，弃去上清，然后加入200μl的LysisBuffer，冰浴裂解30min，4℃、10000g离心10分钟，收集上清。
组织裂解上清的准备：将需要测定的组织(20-50mg)收集到玻璃匀浆器或自动匀浆管中，然后加入0.5ml的LysisBuffer，匀浆1min，4℃、10000g离心10分钟，收集上清。
NADH测定样品的准备：将上述样本，60℃孵育30min，使NAD+分解后，用于NADH测定。
2.试剂盒的准备
NAD/NADH检测工作液的配制：根据待测样品数参考下表配制适当量的NAD/NADH检测工作液，
表中试剂按比例混合后即为NAD/NADH检测工作液。
1个样品
10个样品
50个样品
NAD/NADHAssayBuffer
36μl
0.36ml
1.8ml
EthanolSolution
2μl
20μl
100μl
ADHSolution
2μl
20μl
100μl
CCK-8Solution
10μl
100μl
500μl
3.标准品的准备
在1.5ml离心管中，加入990μl纯水或LysisBuffer，再取10μl的1mM浓度NADH标准品加入离心管中配制10μM浓度NADH标准品；然后取另外6根1.5ml离心管，分别加入500μl纯水或LysisBuffer，再吸取500μl的10μM浓度ATP标准品依次倍倍稀释为5、2.5、1.25、0.625、0.312、0.156μM浓度。
测定方法
参考下表，使用透明96孔板，依次加入标准品或样品、NAD/NADH检测工作液，混匀，室温孵育10-30分钟。
空白对照孔
标准曲线孔
样品孔
纯水或LysisBuffer
50μl
─
─
NADH标准品
─
50μl
─
样品
─
─
50μl
NAD/NADH检测工作液
50μl
50μl
50μl
待反应完成后，利用酶标仪测定相对发光强度450nm波长的吸光度，如果样本中NAD/NADH浓度偏低，可以适当延长反应时间。
数据处理
利用标准品浓度为横坐标，450nm波长的吸光度值为纵坐标制作标准曲线，并获得横纵坐标之间的函数关系式，然后利用标准曲线和各样品的吸光度值计算样品中NAD/NADH浓度。NAD/NADH标曲测定如下图所示：
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