经典总RNA的提取和RTPCR.pptxVIP

◆经典总RNA的提取和RTPCR;完整RNA的提取和纯化,是进行RNA方面的研究工作如Nothern杂交、mRNA分离、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及体外翻译等的前提。

掌握从细胞中提取总RNA的方法

掌握RT-PCR基因扩增的原理和操作方法;实验流程;第一部分;操作步骤;原 理;原 理：Trizol的主要成分;在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在上层水相中。

取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。;仪器和主要试剂;第十页，共三十二页，2022年，8月28日;所有ＲＮＡ的提取过程中都有五个关键点：

样品细胞或组织的有效破碎；

有效地使核蛋白复合体变性；

对内源ＲＮＡ酶的有效抑制；

有效地将ＲＮＡ从ＤＮＡ和蛋白混合物中分离；

对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。;RNA酶污染来源;防止RNA酶污染的措施;RNA完整性检测;RNA降解

组织取出后没有马上处理或冷冻。

待提取RNA的样品没有保存于-60至-70℃，而保存在了-5至-20℃。

细胞在用胰酶处理时过度。

溶液或离心管未经RNase去除处理。E.电泳时使用的甲醛pH值低于了3.5。

DNA污染

样品匀浆时加的试剂量太少

样品中含有有机溶剂(如乙醇，DMSO等)，强缓冲液或碱性溶液;第二部分;仪器和主要试剂;操作步骤;取0.2mlPCR反应管一只，用微量加样枪分别加入各试剂：;提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。

RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。

该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。;RT-PCR-逆转录-聚合酶链反应

mRNA

逆转录酶

杂化双链

ＤＮＡ聚合酶

cDNA

PCR扩增;鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。

最适作用温度为37℃。在长时间的逆转录过程中，不会造成模板的降解，获得cDNA的几率大，适用于较长的cDNA链的合成。

禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和rna酶h活性。最适 作用温度为42???。

Thermusthermophilus、Thermusflavus等嗜热微生物的热稳定性 反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。

MMLV反转录酶的RNaseH-突变体：商品名为Superscript和Superscript

Ⅱ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。;随机六聚体引物：用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA

第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。

Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞 mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。

由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。

特异性引物：是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，用此类引物 仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。;PCR反应系统的组成;（一）模板;(二)引物;u引物的特异性：;（三）Taq酶;本实验所扩增的产物DNA片段长度300bp～400bp,可取5μlPCR产物以1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。利用标准

DNA-marker评估扩增的特异性。;实验材料;溴化乙锭(EB):3,8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴盐)，可与DNA结合,在紫外光照射下呈现红橙荧光,有致癌性.

Gelview:是一种新型核酸染料,可与DNA分子形成复合物，能产生极强的荧光信号，其灵敏度比EB高,且荧光强度与DNA含量成正比荧光,在紫外光照射下呈现绿色荧光.;DNAMarker

含有分子量不同的DNA片段，主要用途就是DNA分子凝胶电泳时，加样用做对比来检测琼脂糖凝胶是否有问题。

应选择在目标片段大小附近ladder较密的marker，这样对目标片段大小的估计较准确。