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PCR扩片段
实验原理
在热稳定DNA聚合酶的作用下，借助一小段引物，体外大量扩增DNA序列。DNA聚合酶具有识别和连接的作用，识别特定位置，并进行连接。引物分为正向引物和反向引物，正向引物（F）、反向引物（R），分别决定了复制的起始和终止。复制的模板是一小段cDNA或是质粒，dNTP是引物扩增的原料，buffer提供了反应环境，其中的Mg2+能够激活DNA聚合酶。一般来说，目的片段越大，需要延伸的时间越长，但循环数相同。
实验步骤
1、准备一个冰盒，先找到以下试剂：
PCRsystem
Volume(μl)
PrimerF
0.5
PrimerR
0.5
Template（100x）
2
dNTPmix
2
Buffer
5
GXL
0.5
ddH2O
14.5
Total
25
加入以上7种试剂，酶要在冰上操作（常温下酶易变性失活）。
PCRprocedure：
94℃2min
98℃10s（使DNA双链充分打开，30s也可以，但不是最佳效率）
56℃15s（引物结合上去的温度）
68℃1kb/min（除去预变性，共34个循环）
68℃5min(尽可能延伸完全)
Ps：PCR扩增的知识点
PCR体系，包含引物、模板、dNTP、buffer、酶和双蒸水。
PCR程序：分为预变性、高温变性、低温退火、适温延伸、再延伸5步。
PCR参数：退火温度不固定，由GC含量而定。如果引物序列和模板DNA序列100%匹配，可以参照随公司引物寄来的表格中提供的Tm值；如果引物5’端加了和模板DNA不匹配序列，如酶切位点或用于同源重组的序列，就不能参照引物合成单上的Tm值，可以用（Tm=2xA或T+4xG或C-5）公式计算。GXL酶的延伸时间是1kb/min。
等待PCR结束后，取3μl扩好的片段，加1μl5xDNAloadingbuffer。
做1%的大孔胶，等胶凝固后，点样，记得同时点DNAmarker（3μl）。120V跑胶10-15min。跑胶的目的是检测DNA片段是否扩出来，以及片段大小是否符合。
胶回收，回收较亮的条带。
三、实验注意事项
退火温度是Tm-5℃，由GC含量来定，GC含量越多，退火温度越高；
不同酶的延伸时间不一样，如GXL高保真酶为1kb/min，Taq酶为2kb/min；
PCR的成败与否，取决于所加入的体系和设置的PCR程序；
模板可以是基因组DNA、cDNA或质粒，如果是质粒，一定要稀释100x。
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