总结总、直接胆红素的检测方法.pdfVIP

血清总胆红素和直接（结合）胆红素测定

目前测定血清胆红素的方法主要有重氮试剂法（包括改良J-G法、二甲亚砜法、二氯苯重氮

盐法和2，5二氯苯重氮四氟硼酸盐法等）、胆红素氧化酶法、钒酸盐氧化法、高效液相色谱

法、导数分光光度法、经皮胆红素测定法以及直接分光光度法等。

改良咖啡因（J-G）法：

一、实验原理

血清中结合胆红素可直接与重氮试剂反应，生成紫色的偶氮胆红素；在同样条件下，未

结合胆红素须有加速剂破坏胆红素氢键后才能与重氮试剂反应。咖啡因、苯甲酸钠作为加速

剂，醋酸钠缓冲液可维持反应的PH值同时兼有加速作用。叠氮钠破坏剩余重氮试剂，终止

结合胆红素测定管的偶氮反应。最后加入碱性酒石酸钠，在碱性条件下，紫色偶氮胆红素转

变为蓝色偶氮胆红素，使最大吸光度由530nm转移到598nm，此时，非胆红素的黄色色素

及其它红色与棕色色素产生的吸光度可忽略不计，使测定的灵敏度和特异性增加。最后形成

的绿色是由蓝色的碱性偶氮胆红素和咖啡因与对氨基苯磺酸之间形成的黄色色素混合而成。

二、实验方法

（一）器材

试管，刻度吸管，分光光度计，37℃水浴箱。

（二）试剂

1．咖啡因-苯甲酸钠试剂无水醋酸钠41g，苯甲酸钠37.5g，乙二胺四乙酸二钠EDTANa2

0.5g，溶于约500mL的蒸馏水中，再加入咖啡因25g，搅拌至完全溶解(不可加热)，然后加

蒸馏水稀释至1000mL，混匀，过滤后放置棕色试剂瓶中，室温保存可稳定6个月。

2.5g/L亚硝酸钠溶液：亚硝酸钠5.0g，加蒸馏水溶解并稀释至100mL，若发现溶液呈淡

黄色时，应丢弃重配。

3.5g/L对氨基苯磺酸溶液：对氨基苯磺酸（NH2C6H4SO3H·H20）5.0g，加于约800mL蒸

馏水中，加浓盐酸15mL，待完全溶解后，加蒸馏水至1000mL。

4.重氮试剂临用前，取5g/L亚硝酸钠溶液（试剂2）0.5mL与5g/L对氨基苯磺酸溶液（试

剂3）20mL混合。

5.5g/L叠氮钠溶液：叠氮钠0.5g，用蒸馏水溶解并稀释至100mL。

6.碱性酒石酸钠溶液：氢氧化钠75g，酒石酸钠(Na2C4H4O6·2H2O)263g，加蒸馏水溶解

并稀释至1000mL，混匀，置塑料瓶中，室温保存可稳定6个月。

7.胆红素标准液可购买，也可按以下方法配制：

（1）稀释血清：收集不溶血、无黄疽、清晰的血清过滤作为混合血清稀释剂。取过滤血清

1.0ml，加生理盐水24ml，混匀。在分光光度计中，以比色杯光径1cm，波长414nm，用生

理盐水调零，读取的吸光度应小于0.100，波长460nm处读取的吸光度应小于0.040。

（2）171umol/L胆红素标准液：称取符合标准的胆红素（MW:584.68）10mg，加入二甲基

亚砜1ml，玻棒搅匀，加入0.05mol/LNa2CO3溶液2ml，使胆红素完全溶解。移入100ml

容量瓶，用稀释血清洗涤数次并移入容量瓶中，缓慢加入0.1mol/LHCl溶液2ml（边加边缓

慢摇动，切勿产生气泡），最后用稀释血清稀释至100ml。避光，4℃保存，三天内有效，最

好当天绘制标准曲线。

（三）步骤

1.取试管3支，标明总胆红素管、结合胆红素管和空白管，然后按下表操作：

试剂(ml)总胆红素管结合胆红素管空白管

血清0.20.20.2

咖啡因-苯甲酸钠试剂1.6-1.6

氨基苯磺酸溶液--0.4

重氮试剂0.40.4-

混匀，总胆红素管置室温10min，结合胆红素管置37℃水浴准确放置1min，按下表继续操

作：

叠氮钠溶液-0.05-