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大熊猫基因资源库构建技术规程

1范围

本标准规定了大熊猫基因资源库构建的技术方法。

本标准适用于大熊猫组织、精液、体细胞（皮肤成纤维细胞、精液与乳汁来源细胞）与成体干细胞

（脐带与骨间充质干细胞）的采集与保存。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB4143-2008牛冷冻精液

GB20557-2006山羊冷冻精液

GB/T31582-2015牛性控冷冻精液

GB/T24863-2010畜禽细胞体外培养与冷冻保存技术规程

GB/T40365-2021细胞无菌检测通则

3术语和定义

下列术语和定义适用于本标准。

3.1大熊猫基因资源库giantpandageneresourcebank

以组织与细胞资源为载体保存大熊猫基因资源，为大熊猫种群可持续性发展提供保障，包括了大熊

猫组织库、精子库以及细胞库。

3.2大熊猫组织资源giantpandatissueresource

在大熊猫死亡后，可获得的各种脏器组织资源，如肌肉组织、肝脏组织等。

3.3大熊猫细胞资源giantpandacellresource

指可从大熊猫体液或组织中分离得到的细胞资源，如精子、体细胞及间充质干细胞等。

3.4电刺激采精electricejaculation

通过微电流直肠电刺激，获得大熊猫精液的方法。

3.5细胞分离cellseparation

通过物理或化学的方法，富集大熊猫体液中的细胞或将组织解离成单个分散的细胞。

3.6细胞培养cellculture

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将细胞在模拟体内生存环境中培养，使其在体外增殖并维持结构和功能的一种方法。

3.7冷冻保存cryopreservation

将组织、精液或细胞经过特殊处理后，在超低温的环境中长期保存的方法。

4基本要求

4.1器具的清洁与消毒

所有器具在使用前需要进行清洁与消毒处理，具体方法见附录A。

4.2细胞分离培养工作区条件

工作区一般要由准备室、缓冲间、无菌室、细胞保存室组成，需满足GB/T24863-2010中对于工作

区条件的要求。

5大熊猫组织库构建技术

5.1组织采集

大熊猫死亡后，获取其各类脏器组织，在RNase-free的4°C生理盐水中迅速漂洗样本，去除血渍和

污物。

5.2组织冷冻

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将组织切成0.2~0.5cm大小的组织块，装入到组织冷冻管中，迅速投入液氮冷冻。填写大熊猫组织

资源保存登记表（见附录C.1），记录采样时间、呼名、谱系号、样品编号、组织类型、采样量、保存

位置。

6大熊猫精子库构建技术

6.1精液采精

选在安静无打扰的兽舍麻醉大熊猫。麻醉后用37°C的生理盐水清洗阴茎，电极棒加涂石蜡油，插

入直肠并确保电极区抵住直肠上壁。调节采精仪，电压2~6V，持续2秒后间歇性休息2秒，出现射精立

刻停止刺激，将精液收集到采精杯中。

6.2精液评估

精液采集后，对其外观、体积、pH值、密度、活力及精子畸形率进行检测，并填写大熊猫精液资

源保存登记表（见附录C.2）。

a)外观：对精液的颜色及气味等一般性状进行常规检查。

b)体积：用1.0mL刻度吸管准确吸取精液体积（参考GB/T31582-2015）。

c)pH值：取2μL精液滴加在pH试纸上，参照比色卡读取精液pH值。

d)密度：取5μL精液，添加995μL3%NaCl溶液，混合均匀后取10μL加入到血球计数池（25×16

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型），在200×相差显微镜下计数。精子密度的计算公式为：密度A×10，其中：A为5个中

方格内精子总数（参考GB20557-2006）。