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GFP基因的克隆和诱导表达

摘要：以质粒E.coliDH5α为模板，扩增GFP基因，并将其转入大肠杆菌，用IPTG诱导剂诱导GFP基因的表达观察。

前言：绿色荧光蛋白GFP（greenfluorescencepro-tein）是1962年Shimomura等从维多利亚多管水母（Aequoreavictoria）中分离并纯化得到的一种自发荧光的蛋白．1992年，Prasher等克隆到编码全长GFP的cDNA，但当时人们对GFP的应用前景还不甚了解．1994年，Chalfie等首次在大肠杆菌和秀丽隐杆线虫中表达了具有荧光性的GFP，开创了GFP蛋白应用研究的先河．维多利亚水母的GFP蛋白是具有238个氨基酸残基的多肽单体，分子量约为27KD．后来，美籍华人Tsien（钱永健）不仅解析了GFP生色基团发光的原理，而且对GFP进行了大胆的改造，目前实验室使用的发光蛋白，大多都是钱永健改造的变种．2008年，诺贝尔化学奖授予OsamuShimomura、MartinChalfie和RogerTsien三位科学家，以表彰他们因发现和发展了绿色荧光蛋白所做的巨大贡献．GFP作为一种新型的报告基因，近年来得到了广泛的应用，可同步跟踪和判断目的基因在转化细胞中的表达情况．GFP广泛用作分子生物学研究的各个领域，转基因研究中一般将目的基因和GFP基因构建成融合表达载体，转入受体细胞中，通过检测GFP蛋白的表达情况，从而检测基因转化情况。本实验主要是通过构建基因表达载体，将含有目的基因的质粒导入大肠杆菌诱导表达并观察。

关键词：GFP基因表达载体诱导表达

正文：

一．材料和方法：

1.实验方法：

1碱裂解法：

1.1.1在含有质粒的DH5α平板菌落上挑取单菌落，接种在20mL含100μg/mLAmp的LB液体培养基中，37℃、200rmp，摇荡培养过夜；

1.1.2分装菌液到1.5mL离心管中，冰浴2min。4℃、12000rmp离心5min，收集菌体，弃上清。再用同样方法重复收集一次菌体；

1.1.3将菌体沉淀重悬于100μL冰预冷的碱裂解液=1\*ROMANI中，旋涡剧烈震荡，混匀。冰浴10min；

1.1.4加200μL新配置的碱裂解液=2\*ROMANII，盖紧管口，轻柔快速颠倒离心管5次，充分混匀（切勿震荡），冰浴5min；

1.1.5加150μL冰预冷的碱裂解液=3\*ROMANIII，盖紧管口，反复颠倒数次，使溶液=3\*ROMANIII在粘稠的细菌裂解液中分散均匀，冰浴10min。4℃、12000rpm离心15min，移上清液至另一1.5mL新离心管中；

1.1.6加等体积酚：氯仿（1:1），震荡混合有机相和水相，冰浴3min。4℃、12000rpm离心10min，吸取上层水相转移到另一新离心管中；

1.1.7加等体积氯仿：异戊醇（24:1），振荡混合有机相和水相，冰浴3min，4℃、12000rpm离心10min，吸取上层水相转移到另一新离心管中；

1.1.8加2倍体积冰预冷的无水乙醇，-20℃沉淀DNA30min，4℃、12000rpm离心10min，弃上清，留沉淀；

1.1.9分2次加入1mL冰预冷的70％乙醇洗涤沉淀，12000rpm离心5min，抽吸去除所有上清，放置室温干燥，让酒精挥发；

1.1.10加25-50μLTE（内含浓度为50μg/mL的RNAaseA）溶解DNA，37℃放置30min，消化RNA，保存在-20℃冰箱中。

1.2琼脂糖凝胶电泳：将提取的质粒用溴酚蓝做前沿指示剂，GoldView做核酸染色剂，进行琼脂糖凝胶电泳，观察结果。

1.3用限制性核酸内切酶对质粒DNA进行酶切：

1.3.1.构建双酶切体系：XhoIPEGFP1μL，pET-28a1μL；NdeIPEGFP1μL，pET-28a1μL；质粒：PEGFP5μL，pET-28a5μL；10×Buffer：PEGFP3μL，pET-28a3μL，用水补足30μL离心10s，混匀。

1.3.2.37℃水浴酶切5-6h。

1.3.3.进行电泳，在紫外观察分析仪上观察酶切的结果。

1.4目的基因的PCR扩增及检测：用PCR的方法对目的基因进行扩增并用琼脂糖凝胶电泳的方法对产物进行检测。PCR反应体系为：10×PCRBuffer（含Mg2+）2.5μL，dNTP（2.5mM）1.0μL，上游引物（10μM）1.0μL，下游引物（10μM）1.0μL，质粒DNA（模板）0.5μL，TaqDNA聚合酶（2.5U/μL）0.3μL，ddH2O18.7μL，混匀