2009年全国高考江苏省地理试题及答案 .pdfVIP

快速、准确的测定用转基因动物zygosity实时定量PCR的方法

Tesson.L

摘要：实时荧光定量PCR技术是在普通PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术,已

广泛应用于不同研究领域。论述了荧光定量PCR技术的基本原理、主要类型和定量实验方

法,探讨了实验条件的控制、影响因素和优化实验结果的方法。

关键词：荧光定量PCR技术;原理;主要类型;定量方法;优化

PCR的机制

使得PCR如此有用的主要科学事实是：每个活的生物体的遗传物质，如植物、动物、

细菌或病毒、都具有存在于它自己物种内的独特的核苷序列基本构件。另外，复杂生物体，

如人类，拥有仅存在于独特个体中的特异性DNA序列。这些独特的差异使得根据遗传物

质回到它的起源，至少确定它来自哪个物种成为可能。

多肽酶链反应是DNA复制，即允许一个目的DNA序列在仅仅几小时内被选择性扩

增或富集几百万倍的一个试管体系。一个分裂细胞内，DNA复制涉及一系列的调控终止反

应，它的最后结果是整个基因组的一个忠实拷贝。在试管中，PCR仅仅使用一种必须得酶，

DNA聚合酶去扩增基因组的一段特异性部分

细胞内DNA复制过程中，酶首先使DNA双链展开松弛并使之变性成为单链。然后，

RNA聚合酶在复制起点合成一小段与DNA得一条链互补的RNA的杂交双链核酸分子作

为DNA聚合酶的引发位点起作用，然后，DNA聚合酶产生互补的DNA链。在PCR过程

中，用高温将DNA分子分开形成单链，并且把人工合成的单链DNA序列作为引物。两个

不同的引物序列被用来把将要被扩增的目标区域括在一起，一个引物在目的区域的开端与

一余DNA链互补第二个引物在目的区域的末端与相反的DNA链的一段序列互补。

为了进行PCR反应，需要在装有缓冲液的试管中加入少量目的DNA，缓冲液中包含

DNA聚合酶，聚核互引物，四中DNA脱氧核苷构件和氯化镁辅助因素。PCR复合体系通

过以下复制循环来进行：

94-96摄氏度，1到几分钟，在此胞间DNA复性成为单链

50-65摄氏度，1到几分钟，在此过程中，引物在目的序列的一段同它们的互补序列

杂交或退火（通过氢键的方式）

70摄氏度，1到几分钟，其间聚合酶从每个引物绑定并扩充与之互补的DNA链

随着扩增的进行，引物之间的DNA序列每逆一次循环就增加一倍。经过三十次这样的循

环，理论上可以达到十亿的扩增数目

两个重要的改变是由于PCR的自动化。首先，从生存在温泉中的栖热水生菌中提取出一种

热稳定的DNA聚合酶。这种酶被称为Taq聚合酶，即使在多次扩增循环中被重复加热，

仍保持活性。第二，发明了DNA热循环化，即使用计算机来控制PCR所需要的重复的温

度改变

当然，一些技术问题可能随着PCR产生。最重要的是体外遗传物质对样品的污染可能

产生不相关的DNA拷贝。这种结果通常是无用的，但有时可能导致错误的结论。针对这

种必然的即使是极少数污染物分子的引入，实验室采取了特殊的预防措施，特别是在实验

之前扩增DNA。在人类应用中，防止污染是一个特殊的挑战，比如药品和法律，照字面地

意思，某些人的生命可能就取决于此。

在扩增之后，PCR产物通常被放入琼脂糖凝胶的点样孔中进行电泳。由于PCR扩增

可能产生微克质量的产物，因此被扩增的片段需经过一种化学原料，如溴化乙锭进行染色

才可能观察到。尽管这种扩增是令人印象深刻的，但要记住的重点是扩增是选择性。只有

位于引物之间的DNA序列被指数扩增。基因组中的余下的DNA不被扩增并且仍然在凝胶

中看不见。

等位基因特异性PCR：

诊断或克隆技术被用来鉴定或利用单核苷酸多态性。它要求提前知道一个DNA序列，

包括等位基因间的不同，并且使用3’末端包含SNP的引物。严格条件下，PCR扩增在模

板和引物间出现错配时效率很低，所以成功的扩增用一个SNP特异性引物表示一个序列中

特意SNP的出现。

组合PCR或聚合酶循环组装（PCA）：

组合PCR是通过在一个带有短重叠片段的长寡聚核苷酸的池中进行PCR来人工合成

长的DNA序列。寡聚核苷酸在正反两方向交替出现，而且重叠片段决定了PCR片段的顺

序，因此，选择性地产生最终的长DNA产物。

RT-PCR

反转录PCR是被用来扩增，分离或鉴定来自细胞或组织的RNA的一段已