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原核表达体系的构建
刘华彬,董浚键
一、实验材料
植物材料:拟南芥
载体及菌株:克隆及测序用载体为pMD18-T,购自Takara公司。宿主菌
DH5α。原核表达载体(pET30c?)。
PCR引物:登陆GeneBank查找目的基因序列,以目的基因序列为模板设计引物。
药品试剂:反转录试剂盒(TaKaRa),质粒小提试剂盒(TIANGEN),胶回收试剂盒,TaqDNA聚合酶(TaKaRa),dNTPs(TaKaRa),限制性内切酶(TaKaRa),T4连接酶(TaKaRa),各种DNA和蛋白marker,各种抗生素类,
二、方法
目的基因的获得(RT-PCR):拟南芥叶片→mRNA→逆转录→cDNA→PCR
→基因(详见王希朝那份);PCR产物用0.8%琼脂糖凝胶分离。先设计好PCR的引物和PCR的反应程序。
克隆载体的构建:
Ⅰ.目的基因的切胶回收:
①在紫外灯下迅速用干净的手术刀切下含目的基因的琼脂糖凝胶块,放入已称重的离心管中,在保证目的基因全部回收的同时,应尽量减少胶的体积。
②计算凝胶重量(100mg相当于100μl),加入3倍体积solutionDE-A,75℃水浴6-8分钟,其间轻柔地颠倒离心管至胶完全融化。
③加入2倍体积solutionDE-B,颠倒混匀,将溶液转移到吸附柱中,室温放置1min,12000rpm离心1min。
④取下吸附柱,倒掉收集管中的废液,加入600μlWashsolution,室温12000rpm离心30s。
⑤重复步骤④一次。
⑥取下吸附柱,倒掉收集管中的废液,室温12000rpm离心1min。
⑦将吸附柱放入新的1.5mL灭菌离心管中,在柱膜中央加入30μl75℃预热的ddH2O,室温放置2min,12000rpm离心1min。离心管中的液体即为回收的目的基因片段,可立即使用或保存于-20℃备用。
Ⅱ.目的片断与克隆载体pMD18-T连接:
pMD19-TSimpleVector(T载体,小纸盒子中)
1ul
InsertDNA
2ul
5ul
dH2O
2ul
SolutionI(冰中融化,小纸盒子中,跟T载体一起)
5ul(等量)
16℃反应30min
Ⅲ.E.coliDH5α感受态细胞的制备:
①将E.coliDH5α在LB平板上划线培养过夜。次日,挑取单克隆,接种到5mLLB培养基中,37℃,200r/min振荡培养过夜。
②将过夜培养的菌液1mL加入到100mLLB培养基中(1:100),培养2-3h至OD600=0.5,转入预冷的无菌离心管中,冰上放置10min,然后于4℃下3000rpm离心10min。
③弃去上清,用预冷的0.05mol/L的无菌CaCl2溶液10mL轻轻悬浮细胞,冰上放置20min,4℃下3000rpm离心10min。
④弃去上清,加入4mL预冷的含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。
⑤感受态细胞分装成100μl的小份,于冰上备用,或液氮速冻贮存于
-80℃。
Ⅳ.重组质粒转化E.coliDH5α(热击法)
连接产物加至感受态E.coliDH52(200ul)或(100ul) 【非连接载体加2ul】 【加入后离火远点轻轻用手拨】
↓
冰上放置20min
↓
42℃水浴热击90s
↓
立即放置冰上2min(勿震荡)
↓
于超净工作台加800ulLB培养液
↓
37℃,150rpm预培养50min
↓
6000rpm离心1min,吸除800ul上清;剩余液体用来悬浮沉淀
↓
涂布LB+Amp平板上,37℃倒置培养12h(于超净工作台吹干液体)。Ⅴ.挑取白色单克隆菌落,重悬于5μlddH2O中,取其中1μl用于PCR鉴
定。PCR反应体系和反应程序同上面获取目的基因的PCR一样。
Ⅵ.重组质粒的提取(TIANGEN质粒小提试剂盒,方法可以看试剂盒说明书)
①将以上剩余的4μl菌液接种到5mL含Amp抗生素的LB液体培养基中,37℃振荡培养过夜。
②取3mL菌液,室温12000rpm离心1min。
③弃上清,加入250μlSolutionI,重悬菌体细胞。
④加入250μlSolutionⅡ,轻柔颠倒离心管4-6次。
⑤加入350μlSolutionⅢ,轻柔颠倒离心管6-8次,此时应出
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