核酸的提取及相关.ppt

二、琼脂糖凝胶电泳特性1．DNA分子大小：线性DNA分子在一定琼脂糖浓度内的迁移率与DNA分子量的对数成反比。2．琼脂糖浓度：小于0.5kb的DNA片段所需的凝胶浓度为1.2-1.5%;分离大于10kb的DNA片段所需的凝胶浓度为0.3-0.7%;DNA片段大小在两者之间的所需的凝胶浓度为0.8-1.0%。分离不同大小DNA片段的合适琼脂糖凝胶浓度琼脂糖（%）分离DNA片段的有效范围（kb)0.51-300.70.8-121.00.5-101.20.4-71.50.2-3在0.5XTBE缓冲液中，溴酚兰相当于300bpDNA,二甲苯氰FF相当于4000bpDNA.第64页,共89页，2024年2月25日，星期天二、琼脂糖凝胶电泳特性3、DNA分子构象：对相同分子量的质粒DNA的三种构象，超螺旋DNA移动最快，而线状双链DNA移动最慢。4．电源电压：在低电压时，线性DNA片段的移动速率与所加电压成正比，但电压增高，不同分子量的DNA片段的移动速率将以不同幅度增加；片段越大，升高的幅度也越大。因此电压增高，琼脂糖有效分离范围将缩小。一般所加电压不得超过5V/cm.5．染料：溴化乙啶（EB），它可嵌入堆积的碱基对之间，在紫外灯下发荧光，检测DNA的下限可达1-10ng。注意：EB是强诱变剂！6、离子强度：在没有离子强度时，DNA几乎不移动，在高离子强度下，则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。常见的电泳缓冲液为0.5xTBE及0.5xTAE,尤其前者更为常见。第65页,共89页，2024年2月25日，星期天第66页,共89页，2024年2月25日，星期天三、试剂：1、5?TBE缓冲液：Tris.54g,硼酸27.5g,加入20ml的0.5mol/LEDTA(pH8.0),定溶至1000ml.2、6?上样缓冲液：0.25%溴酚兰,40%(w/v)蔗糖水溶液。3、溴化乙啶（EB）溶液母液：将EB配制成10mg/L，用铝箔或黑纸包裹容器，储于温室即可。4、DNA分子量标准：?DNA/EcoRI/HindIII:?DNA/EcoRI:21.2,7.4,5.8,5.6,4.9和2.5kb。?DNA/HindIII:23.1,9.4,6.6,4.4,2.3,2.0,0.56和0.12kb.第67页,共89页，2024年2月25日，星期天四、实验步骤1、稀释缓冲液的制备：用蒸馏水将5?TBE缓冲液配制成0.5?TBE稀释缓冲液.2、胶液的制备：称取0.4g琼脂糖，置于200ml三角烧瓶中，进入50ml的0.5?TBE稀释缓冲液，放入微波炉或电炉加热至琼脂糖全部熔化，取出混匀。3、胶板的制备：将二端封闭的电泳槽置于水平支持物上，插上样品梳子。在冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入EB溶液至终浓度为0.5?g/ml,即10mg/ml的母液加2.5ul，混匀。小心地倒入电泳槽中至一定高度。待胶液完全凝固后拔出梳子。然后向槽内加0.5?TBE稀释缓冲液至液面刚好没过胶板表面。第68页,共89页，2024年2月25日，星期天四、实验步骤4、加样：取2-5?l样品加1?l的6?上样缓冲液，用移液枪混匀（在Parafilm膜上操作），小心加到样品槽中。同时加DNA分子量标准对照。5、电泳：从负极到正极，60-80V,电流40mA以上。当溴酚兰条带移动至距凝胶前沿约2cm时，停止电泳。6、观察和拍照：在波长为254nm的紫外灯下，观察DNA电泳带并估计其分子量大小。同时可用加红色滤光片和近摄镜片的相机拍照（光圈5.6下暴光10-120秒）。第69页,共89页，2024年2月25日，星期天(II)、RNA凝胶电泳第70页,共89页，2024年2月25日，星期天一、概述RNA分子有很多二级结构，需经变性剂处理，可以破坏RNA中的二级结构。然后，用琼脂糖凝胶电泳可分级分离不同大小的mRNA分子。常用的RNA琼脂糖凝胶电泳方法有三种:乙二醛变性电泳、甲醛变性电泳和羟甲基汞琼变性电泳。第