染色体显微操作技术.ppt

染色体DNA作图文库物理图谱大分子DNA的提取大片段DNA的克隆物理作图物理作图的主要环节第32页,共61页，2024年2月25日，星期天2.染色体显微切割的应用2.1感兴趣区域DNA克隆的构建2.2FISH探针的制备为了检测以前不可辨认的肿瘤和遗传病的染色体异常，已普遍采用全染色体探针的荧光原位杂交技术。为满足日益增多的高质量染色体涂染探针的需求，染色体显微切割已用于许多FISH探针的制备，包括所有人类的染色体涂染探针、染色体臂涂染探针和区带特异性涂染探针。2.3染色体重排的检测2.4区域特异性cDNA的选择第33页,共61页，2024年2月25日，星期天染色体涂染技术染色体涂染技术即将整条染色体、某条染色体臂（长臂或短臂）或者染色体某个片断的DNA制备成探针，然后用荧光原位杂交的方法，将探针杂交到中期分裂相染色体上，在荧光显微镜下观察荧光素在染色体上标记的颜色，从而分析和研究染色体的重组、畸变以及同源基因等的一种新技术。第34页,共61页，2024年2月25日，星期天染色体涂染第35页,共61页，2024年2月25日，星期天第36页,共61页，2024年2月25日，星期天第37页,共61页，2024年2月25日，星期天染色体涂染技术1.染色体DNA探针的制备2.荧光原位杂交①流式细胞分类法；②克隆基因库或体细胞杂交株；③染色体显微切割和PCR扩增等途径。第38页,共61页，2024年2月25日，星期天1.染色体DNA探针的制备①流式细胞分类法（flowcytometry）该法用一种或多种荧光染料将悬浮液中的中期分裂相染色体染色。由于染色体大小、形态、组成和结构的不同，所染色的特征有其特异性，从而可以通过流式细胞术将特定的染色体收集起来。局限性：如果受试物的染色体形态单一、数目较多,仅根据染色体的形态和大小很难将所有的染色体准确地区分开来。第39页,共61页，2024年2月25日，星期天局限性：如果受试物的染色体形态单一、数目较多，如牛(2n=60)和狗(2n=78)的所有常染色体及绵羊(2n=54)和马(2n=64)的大部分常染色体都是端位着丝点，因此，仅根据染色体的形态和大小很难将所有的染色体准确地区分开来。第40页,共61页，2024年2月25日，星期天1.染色体DNA探针的制备②克隆基因库或体细胞杂交株通过特定的克隆基因文库或者特异性的体细胞杂交细胞系制备某条染色体整个或部分DNA探针。该法特异性强，准确性高，且可与功能遗传学的研究结合起来，但对实验室要求较高，取材来源和研究范围有所限制。③染色体显微切割和PCR扩增通过该方法制备的染色体DNA探针，相对而言，具有直接、准确、简便和应用范围广等优点。第41页,共61页，2024年2月25日，星期天2.荧光原位杂交（fluorescentinsituhybridazation,FISH）原位杂交是基于DNA分子复制原理而发展起来的一种技术。用带有标记（放射性同位素、荧光染料等）的DNA或RNA片段作为核酸探针,与组织切片或细胞内待测核酸(RNA或DNA）片段进行杂交，然后用放射自显影等方法予以显示，在光镜或电镜下观察目的mRNA或DNA的存在及定位。第42页,共61页，2024年2月25日，星期天2.荧光原位杂交荧光原位杂交是在20世纪80年代末在放射性原为杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术，以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法。探针首先与某种介导分子结合，杂交后再通过免疫细胞化学过程连接上荧光染料。第43页,共61页，2024年2月25日，星期天基本原理：如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。第44页,共61页，2024年2月25日，星期天实验流程：FISH样本的制备→探针的制备→探针标记→杂交→（染色体显带）→荧光显微镜检测→结果分析。第45页,共61页，2024年2月25日，星期天优点:荧光试剂和探针经济、安全；探针稳定