常见问题分析及解决策略.ppt

关于常见问题分析及解决策略PCR技术简介PCR常见问题、原因分析及其解决方案提高PCR反应特异性的策略临床PCR检测的常见问题定量PCR常见问题第2页,共27页，2024年2月25日，星期天PCR标准反应体系DNA模板引物反应缓冲液Mg2＋浓度dNTPsdH2O耐热聚合酶第3页,共27页，2024年2月25日，星期天反应体系对PCR扩增的影响DNA模板纯度蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制PCR反应完整性模板降解会导致PCR扩增无产物浓度加量过多导致非特异性扩增增加引物特异性长度适当、避免二级结构和二聚体完整性避免反复冻融浓度应适当,过高导致非特异性增加,过低则扩增产物太少第4页,共27页，2024年2月25日，星期天反应体系对PCR扩增的影响过高非特异性严重过低无扩增产物浓度适当避免反复冻融pH值适当避免污染pH值,盐离子浓度稳定剂,增强剂反应缓冲液dNTPsdH2OMg2＋浓度第5页,共27页，2024年2月25日，星期天如何选择最合适的DNA聚合酶PCR用耐热DNA聚合酶Taq酶pfu酶HotstartTaq酶混合酶TaqplusLongTaqTaqplatinum第6页,共27页，2024年2月25日，星期天特异性-----基因组扩增、RT-PCR保真性-----基因筛选、测序、克隆长片段扩增-----构建基因图谱、测序等扩增效率-----复杂模板扩增（GC含量高、二级结构）PCR试剂盒-----复杂模板扩增、大规模基因检测如何选择最合适的DNA聚合酶-----根据PCR实验需求第7页,共27页，2024年2月25日，星期天PCR常见问题之一-----无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无M12正对照原因模板含有抑制物，含量低Buffer对样品不合适引物设计不当或者发生降解反应条件：退火温度太高，延伸时间太短纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量更换Buffer或调整浓度重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物降低退火温度、延长延伸时间对策第8页,共27页，2024年2月25日，星期天PCR常见问题之二-----非特异性扩增现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。原因对策引物特异性差模板或引物浓度过高酶量过多Mg2+浓度偏高退火温度偏低循环次数过多重新设计引物或者使用巢式PCR适当降低模板或引物浓度适当减少酶量降低镁离子浓度适当提高退火温度或使用二阶段温度法减少循环次数第9页,共27页，2024年2月25日，星期天PCR常见问题之三-----拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态M12原因对策模板不纯Buffer不合适退火温度偏低酶量过多dNTP、Mg2+浓度偏高循环次数过多纯化模板更换Buffer适当提高退火温度适量用酶适当降低dNTP和镁离子的浓度减少循环次数第10页,共27页，2024年2月25日，星期天PCR常见问题之四-----假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物原因靶序列或扩增产物的交叉污染对策操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。第11页,共27页，2024年2月25日，星期天提高PCR反应特异性策略巢式PCR（Nest-PCR）递减PCR（TouchDownPCR）热启动PCR（HotStartPCR）使用PCR增强剂第12页,共27页，2024年2月25日，星期天策略之一巢式PCRPF1PR1PF2PR2巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同多套引物都互补的靶序列很少。巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5RACE）的特异性。第13页,共27页，2024年2月25日，星期天策略之二递减PCR递减PCR通过在PCR的前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循环设在比估算的Tm高大约5℃的退火温度下开