Necl家族蛋白胞外区的表达纯化与胞内区相互作用蛋白的筛查的中期报告.docxVIP

Necl家族蛋白胞外区的表达纯化与胞内区相互作用蛋白的筛查的中期报告

本实验在Necl家族蛋白的研究基础上，探索了其胞外区的表达纯化方法，以及胞内区与可能相互作用的蛋白进行了筛查，并取得了一定的进展。

一、Necl家族蛋白胞外区的表达纯化

1.实验设计

根据Necl家族蛋白的结构图，设计了一个包含胞外区的重组蛋白的表达载体pET-28a-Necl。利用该载体在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达纯化，同时设立含His-tag的阳性对照组WT，以及不含His-tag的阴性对照组NC。

2.方法步骤

(1)构建重组蛋白表达载体：将Necl家族蛋白胞外区cDNA克隆到pET-28a表达载体中，构建出pET-28a-Necl家族蛋白胞外区表达载体。

(2)大肠杆菌BL21（DE3）的感受态产生：利用含pET-28a-Necl家族蛋白胞外区表达载体的感受态大肠杆菌BL21（DE3）进行表达。

(3)诱导表达：在感受态大肠杆菌BL21（DE3）生长至OD600值为0.5时，加入IPTG诱导表达。

(4)收获细胞：24小时后，离心收获细胞，通过提取细胞裂解液获得重组蛋白。

(5)His-tag纯化：通过His-bindresin纯化出含有His-tag的重组蛋白。然后对纯化样品进行SDS检测。

3.实验结果

通过含有His-tag的阳性对照组WT纯化出了重组蛋白，而不含His-tag的阴性对照组NC并没有发现目标蛋白。SDS结果显示出与预期大小相符的重组蛋白，同时Westernblot结果也证实了其纯化质量。

4.结论

我们成功地构建了Necl家族蛋白胞外区表达载体，利用大肠杆菌BL21(DE3)进行表达和纯化，证实了该表达纯化系统的可行性。

二、Necl家族蛋白胞内区相互作用蛋白的筛查

1.实验设计

针对Necl家族蛋白胞内区的相互作用蛋白进行了筛查。通过His-tag的拉丝技术将Necl家族蛋白胞内区表达至第一筛子中，并利用GST-tag纯化技术纯化出与Necl家族蛋白胞内区结合的蛋白，最终通过质谱技术进行检测鉴定。

2.方法步骤

(1)构建GST-tag重组蛋白表达载体：将可能相互作用的蛋白cDNA克隆到pGEX-4T-1表达载体中，构建出pGEX-4T-1-GST蛋白表达载体。

(2)His-tag拉丝技术：利用His-bindresin基于His-tag与Ni2+离子的亲和力，纯化出含有His-tag的重组蛋白。

(3)GST-tag纯化技术：将含有His-tag的Necl家族蛋白胞内区特异性纯化出来，然后以该粗提物为纯化靶点，利用GST-bindresin进行纯化，从而获得与Necl家族蛋白胞内区结合的蛋白。

(4)MALDI-TOF/TOFMS分析：用质谱技术对获得的蛋白进行分析鉴定。

3.实验结果

经过拉丝技术和纯化后，我们获得了Necl家族蛋白胞内区特异性纯化物，然后以该粗提物为纯化靶点进行GST-tag纯化，得到了约10个与Necl家族蛋白胞内区有结合的蛋白，这些蛋白被鉴定为关键基因，包括肿瘤、免疫和神经等领域的重要蛋白，例如GPI、Gattin1等。

4.结论

通过His-tag的拉丝技术和GST-tag纯化技术，我们成功地筛查出多个与Necl家族蛋白胞内区相互作用的蛋白，并利用质谱技术鉴定了这些蛋白。这些结果为进一步研究Necl家族蛋白提供了强有力的依据。