液相色谱的结构原理和基本知识 液相色谱操作规程.pdf

液相色谱操

作规程

液相色谱(HPLC)法是以高压下的液体为流动相，并采用颗粒极

细的固定相的柱色谱分离技术。液相色谱对样品的适用性广，不受

分析对象挥发性和热稳定性的限制，因而弥补了气相色谱法的不足。

在目前已知的有机化合物中，可用气相色谱分析的约占20%，而80%

则需用液相色谱来分析。

液相色谱和气相色谱在基本理论方面没有显著不同，它们之间

的重大差别在于作为流动相的液体与气体之间的性质的差别。

液相色谱分析原理

(1)、液相色谱分析的流程：由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系

统，然后输出，经流量与压力测量之后，导入进样器。被测物由进

样器注入，并随流动相通过色谱柱，在柱上进行分离后进入检测器，

检测信号由数据处理设备采集与处理，并记录色谱图。废液流入废

液瓶。遇到复杂的混合物分离(极性范围比较宽)还可用梯度控制器

作梯度洗脱。这和气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱改

变温度，而HPLC改变的是流动相极性，使样品各组分在佳条件下得

以分离。

(2)、液相色谱的分离过程：同其他色谱过程一样，HPLC也是

溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。它借溶

质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排

阻作用的差别使不同溶质得以分离。

开始样品加在柱头上，假设样品中含有3个组分，A、B和C，

随流动相一起进入色谱柱，开始在固定相和流动相之间进行分配。

分配系数小的组分A不易被固定相阻留，较早地流出色谱柱。分配

系数大的组分C在固定相上滞留时间长，较晚流出色谱柱。组分B

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A，C之间，第二个流出色谱柱。若一个含有多个组

分的混合物进入系统，则混合物中各组分按其在两相间分配系数的

不同先后流出色谱柱，达到分离之目的。

不同组分在色谱过程中的分离情况，首先取决于各组分在两相

间的分配系数、吸附能力、亲和力等是否有差异，这是热力学平衡

问题，也是分离的首要条件。其次，当不同组分在色谱柱中运动时，

谱带随柱长展宽，分离情况与两相之间的扩散系数、固定相粒度的

大小、柱的填充情况以及流动相的流速等有关。所以分离终效果则

是热力学与动力学两方面的综合效益。

工作原理

储液器中的流动相被高压泵打入系统,样品溶液经进样器进入流

动相,被流动相载入色谱柱(固定相)内,由于样品溶液中的各组分

在两相中具有不同的分配系数,在两相中作相对运动时,经过反复

多次的吸附-解吸的分配过程,各组分在移动速度上产生较大的差别,

被分离成单个组分依次从柱内流出,通过检测器时,样品浓度被转

换成电信号传送到记录仪,数据以图谱形式打印出来。

HPLC的特点和优点

HPLC有以下特点：

高压压力可达150~300Kg/cm2。色谱柱每米降压为75Kg/cm2

以上。

高速流速为0.1~10.0ml/min。

可达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100种。

高灵敏度紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。

HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：

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15~30min，有些样品甚至在5min

内即可完成。

分辨率高可选择固定相和流动相以达到佳分离效果。

灵敏度高紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达

0.1pg。

柱子可反复使用用一根色谱柱可分离不同的化合物。

样品量少，容易回收样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单

一组分或做制备。

液相色谱的五大系统

1、进样系统

进样系统分为手动进样阀和自动进样器。

手动进样阀

对于手动进样阀使用过程中需要注意每个样品进样完成后应对

进样阀进行清洗，防止残留对下一个样品分析的影响。还需要注意

进样方式，以20L定量环为例，我们可以