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一、实验原理
(1).碱性磷酸酶的分离纯化
机械破碎法制备肝匀浆
低浓度乙酸钠:低渗破膜
低浓度乙酸镁:保护和稳定AKP
2.有机溶剂沉淀法分离纯化AKP
加入不同有机溶剂重复离心
正丁醇:沉淀部分除AKP的蛋白质
33%丙酮、30%乙醇:溶解AKP
50%丙酮、60%乙醇:沉淀AKP
(2).比活性测定
1.比活性的定义
*单位重量的蛋白质样品中所含的酶活性单位。
*通常用每毫克蛋白质具有的酶活性单位来表示。
*用以鉴定酶的纯化程度,是酶分离提纯完成的评价指标之一。
2.测定样品的比活性必须测定:
每毫升样品中的酶活性单位数。
*每毫升样品中的蛋白质毫克数。
(3).米氏常数测定
m即为米氏常数,Vmax为最大反应速度
*如上式表示,米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度,因此,
米氏常数的单位为mol/L。
当反应速度等于最大速度一半时,即=1/2Vmax,Km=[S]*吸光度表示不同底
物浓度时的酶反应速度。以吸光度的倒数作纵坐标,
以底物浓度的倒数作横坐标,按Lineweaver-Burk作图法可求出Km值。
.器材
721分光光度计台式离心机恒温水浴锅微量移液器
托盘天平匀浆器试管
三.试剂
1.0.5mol/L醋酸镁溶液称取醋酸镁5.3625g溶于蒸馏水中,
稀释至50ml.
2.0.1mol/L醋酸钠溶液称取醋酸钠0.0820g溶于蒸馏水中,
稀释至10ml.
3.0.01mol/L醋酸镁醋酸钠溶液取0.5mol/L醋酸镁溶液2ml
及0.1mol/L醋酸钠溶溶液10ml,混合均匀后加蒸馏水稀释至100ml.
分析纯).
5.95%乙醇(分析纯).
6.Tris缓冲液(Ph8.8)称取Tris6.05g,用蒸馏水溶解成50ml,为0.1mol/LTris
液,取0.1mol/LTris液10ml,加0.5mol/L醋酸镁2ml,加蒸馏水80ml,再用1%醋酸
调pH至8.8,然后用蒸馏水稀释至100ml.
Co
7.0.01mol/L基质液称取磷酸苯二钠(HPONa2H)0.3g,
6542.2
4-氨基安替比林0.15g,分别溶于煮沸冷却后的蒸馏水中;两液混合并蒸馏水稀
释至50ml,加0.2ml氯仿防腐,盛于棕色瓶中,冰箱内保存,可用一星期;临用时与等
量0.1mol/LpH10的碳酸盐缓冲液混合即可.
8.0.1mol/LpH10的碳酸盐缓冲液称取无水碳酸钠0.318g及碳酸氢钠0.168g溶
于蒸馏水,稀释至50ml.
9.碱性溶液量取0.5mol/L氢氧化钠溶液与0.5mol/L碳酸氢钠溶液各20ml,混
合后加蒸馏水至100ml.
10.0.5%铁氰化钾溶液称取铁氰化钾0.25g和硼酸0.75g,各溶于20ml蒸馏水中,
溶解后两液混合均匀,再加蒸馏水至50ml,置棕色瓶中暗处保存.
11.0.1mol/L醋酸镁溶液称取醋酸镁0.2145g溶于蒸馏水中,稀释至10ml.
12.酚标准液(0.1mg/ml).
四.实验步骤
(1).碱性磷酸酶分离纯化”实验操作
”实验操作
样品中碱性磷酸酶活性测定:
(1).取5支试管,编号,按表1操作:
表1
AB’C’D’标准空白
各阶段稀释液(ml)0.10.10.10.1--
0.1mg/ml酚标准液(ml)----0.1-
pH8.8Tr
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