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)宏基因组测序讲解

相关的代谢通路，以及通过不同样品的比较研究微生物内部、

微生物与环境以及与宿主的关系。宏基因组，也称为微生物环

境基因组或元基因组，是由Handelsman等于1998年提出的新

名词。它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，主要指

环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。宏基因组学是一种以

环境样品中的微生物群体基因组为研究对象的微生物研究方法。

它通过功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多

样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及与

环境之间的关系为研究目的。一般XXX包括从环境样品中提

取基因组DNA，进行高通量测序分析，或克隆DNA到合适

的载体，导入宿主菌体，筛选目的转化子等工作。

宏基因组文库是一种重要的研究工具，可以利用转入大肠

杆菌中的宏基因组DNA载体，使以前无法研究的不可培养微

生物的DNA得到复制、表达，从而进行研究。所有带有宏基

因组DNA载体的模式微生物克隆构成宏基因组文库。对于宏

基因组文库的DNA进行分析，有很多分析方法，主要分为表

型功能筛选和序列基因型分析两类。表型功能筛选是利用模式

达抗菌物质的克隆。而序列基因型分析则是对文库中所有或部

分的进行测序分析，以应用于生态学研究，例如分析文

库中16SrRNA序列，对所研究生态环境的多样性进行评估。

一个典型的宏基因组分析涉及多个轮次，以确保从生态环境标

本中分离到目的基因，并尽可能多地分析DNA序列所编码的

信息。

XXX是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对

象的新的微生物研究方法。它主要通过功能基因筛选和测序分

析来研究微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相

互协作关系及与环境之间的关系。在宏基因组学研究中，样品

总DNA的提取及基因或基因组DNA的富集是非常关键的步

骤。提取的样品DNA必须可以代表特定环境中微生物的种类，

获得高质量环境样品中的总DNA是宏基因组文库构建的关键

之一。因此，应选择合适的方法，既要尽可能地完全抽提出环

境样品中的DNA，又要保持较大的片段以获得完整的目的基

因或基因簇。同时，应严格操作，谨防污染，并且保持DNA

片段的完整和纯度。目前已有许多商品化宏基因组DNA提取

提取

方法的改进。

为了提高阳性克隆的占有率，需要对感兴趣的基因或基因

组进行富集。稳定同位素示踪技术是较好的富集方法之一。另

外，抑制性消减杂交技术是一项非常有用的技术方法，可以富

集特定基因，并证实微生物之间基因的不同。

宏基因组文库的构建策略取决于研究的整体目标。在选择

克隆载体和宿主菌株时，需要考虑转化效率、宏基因的表达、

重组载体在宿主细胞中的稳定性以及目标性状的筛选等因素。

大肠杆菌是最常用的宿主菌株，但不同微生物种类所产生的活

性物质有明显差异，因此需要选择不同的宿主菌株。

在宏基因组文库的筛选过程中，需要注意选择合适的筛选

方法和条件，以提高阳性克隆的占有率。具体筛选方法和条件

的选择应根据研究的目的和样品的特点进行。

功能性筛选法是一种基于活性测定的筛选方法，通过建立

和优化合适的方法从基因组文库中获得具有特殊功能的克隆。

这种筛选方法不需要已知序列的信息，能够快速找到可用于工

农业和医药的蛋白质和天然产物。功能性筛选的方法有两种，

因的宿主菌株与其突变体在选择性条件下功能互补生长的特性

进行。

虽然功能性筛选法的筛选过程比较简单、快速，但是这种

筛选方法依赖于目的基因在新的宿主中表达。使用模式微生物

并不能把所有的宏基因组DNA表达出来，而且要求克隆到基

因或基因簇的全长。一旦克隆过程中破坏基因某个组件将使得

基因没法表达，也就不能根据功能进行筛选，故检出的概率很

低，工作量大，往往从上万个克隆中只能筛选到几个有用的克

隆。

底物诱导基因表达筛选(SIGEX)是一种用于能利用各种底

物诱导的分解代谢型基因的检出，并结合生物发光技术用来筛

选代谢相关基因及酶基因的方法。通常，编码相关代谢基因或

酶基因呈簇存在，与该物质诱导的启动子和同源转录调控序列

毗邻，往往在有底物诱导的条件下才表达，反之则不表达。首

先构建一个含有绿色荧光蛋白(GFP)的表达载体，将宏基因组