原核生物的基因表达与操作.ppt

*溶解和准备样品重新悬浮细胞沉淀物於5ml溶解缓冲液(e.g.): 20mMTris?-HCl,0.5MNaCl,

5mM咪唑,6M盐酸胍,

1mM2-巯基乙醇pH8在室温等30-60分钟在+4oC离心15分钟用0.22μm或0.45μm濾膜过滤第63页,共75页，2024年2月25日，星期天载体和标记 纯化pGEX

谷胱甘肽S-转移酶 GSTMicroSpin?PurificationModule,

GSTrap?,GlutathioneSepharose?FastFlowPQE

6x组氨酸 HisMicroSpinPurificationModule pET HisTrap?,HiTrap?Chelating,

6x组氨酸 ChelatingSepharoseFastFlowpEZZ18(非诱导性表达)

蛋白A的IgG结合区 IgGSepharose6FastFlowpRIT2T(利用温度改变诱导) 蛋白A的IgG结合区 IgGSepharose6FastFlow亲和层析纯化第64页,共75页，2024年2月25日，星期天*GST融合蛋白的纯化GST重组蛋白酶切位点FactorXa: Mr17-20000/28-30000Thrombin: Mr37000PreScission?Protease: Mr46000GlutathioneSepharose?Mr2600010C第65页,共75页，2024年2月25日，星期天*SDSPAGEanalysis020406080100%Elutionbuffer00.51.01.52.02.53.03.55.010.015.020.0mlminWashElutionbuffer2.7mgpureGSTfusionprotein5.010.015.020.0A280kD9414.420.1304367123柱: GSTrap1ml样品: 8ml大肠杆菌表达含GST融合蛋白胞浆萃取液结合缓冲液: PBS,pH7.3洗脱缓冲液 50mMTris?-HCl,pH8.0＋10mM还原谷胱甘肽流速: 1ml/min层析

步骤: 4CV结合缓冲液,8ml样品,10CV结合缓冲液,

5CV洗脱缓冲液,5CV结合缓冲液(CV=柱体积)系统: ?KTA?explorer101: 低分子量标记(LMW)Calibrationkit,

还原,AmershamPharmaciaBiotech2: 胞浆萃取液,1g/10ml3: 洗脱GST融合蛋白第66页,共75页，2024年2月25日，星期天*(His)6融合蛋白的纯化和检测重组蛋白HisHisHisNi2+HisHisHisHisNi2+Ni2+Ni2+第67页,共75页，2024年2月25日，星期天第68页,共75页，2024年2月25日，星期天*SDSPAGEFlowthrough加样结合液洗脱液结合液AA280280AA4054051.00.50.00.700.600.500.400.300.200.100.05.010.015.020.0Volume(ml)ElutedpoolWashkDa94.067.043.020.114,412345678样品: 5ml大肠杆菌表达含(His)-标记谷胱甘肽转移酶，

GST-(His)6

柱: HiTrapChelating1ml,加Ni2+结合缓冲液: 1X磷酸缓冲液,20mM咪唑pH7.4洗脱缓冲液: 1X磷酸缓冲液,500mM咪唑pH7.4流速: 2ml/min,312cm/h结果: 洗脱GST-(His)6,4ml,

A280:1.65总量:4.46mg1: 低分子量标记(LMW)2: 样品稀释1:203: 穿透