原位分子杂交组织化学.ppt

关于原位分子杂交组织化学一、概念用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合，形成杂交体，然后再用与标记物对应的检测系统，通过组织化学或免疫组织化学方法在核酸原有位置进行细胞内定位。第2页,共29页，2024年2月25日，星期天二、原位杂交的基本原理第3页,共29页，2024年2月25日，星期天三、原位杂交组织化学技术的应用1.细胞特异性mRNA转录的定位；2.癌基因、抑癌基因及各种功能基因在转录水平的表达及其变化的研究；3.病原微生物检测；4.基因在染色体上的定位；5.检测染色体的变化；6.分裂间期细胞遗传学的研究。第4页,共29页，2024年2月25日，星期天四、核酸探针的种类根据探针的核酸性质不同DNA探针、RNA探针、cDNA探针、cRNA探针、寡核苷酸探针根据探针的标记方法不同放射性探针：32P、3H、35S非放射性探针：生物素标记地高辛标记荧光标记第5页,共29页，2024年2月25日，星期天DNA探针1.克隆在质粒载体中，可以无限增殖，制备简便。2.不易降解。标记的方法较成熟多样（切口平移等）cDNA探针1.互补于mRNA的DNA分子。2.逆转录合成，不含内含子序列，适宜基因表达的检测。单链比双链灵敏度高，且不需变性，使能与靶mRNA结合的探针浓度提高。第6页,共29页，2024年2月25日，星期天cRNA探针单链分子，杂交反应效率高。可控制转录方向，得到同义RNA探针（与mRNA同序列），或反义RNA探针（cRNA，与mRNA互补）。可检测DNA和mRNA，还可观察基因的转录状况。易于降解，标记方法复杂。寡核苷酸探针链短、分子量小、序列复杂度低，杂交时间比克隆探针短。可识别靶序列中一个碱基的变化，故成套探针用于碱基点突变的检测。一次可大量合成，价格低廉，易于标记。缺点：与克隆探针比较，特异性差，杂交信号弱。第7页,共29页，2024年2月25日，星期天设计筛选寡核苷酸探针的原则长30-50bp，长探针则杂交时间长，短则特异性差。碱基成分：G＋C含量为40%-60%。探针分子内不能有互补区。第8页,共29页，2024年2月25日，星期天探针种类优点缺点cDNA1.制备简单2.放射比活性高3.信号特异性强4.杂交体较稳定1.变性后才能使用2.要基因克隆3.组织穿透力差4.易于退火cRNA1.信号特异性强2.不需变性3.杂交后可用RNase除去未杂交的探针4.杂交体非常稳定5.不会退火1.易被Rnase降解2.易吸附于器皿上3.组织穿透力差4.需做亚克隆寡聚核苷酸1.易制备2.使用方便3.组织穿透力强4.不需做克隆5.不会退火6.只要知道氨基酸顺序便可制备探针1.需核酸合成仪2.需明确mRNA顺序3.单碱基错误将影响杂交4.杂交体不太稳定第9页,共29页，2024年2月25日，星期天五.探针标记探针的标记物分为放射性标记和非放射性标记两大类：放射性标记物一般为125I、35S或32P；非放射性标记有生物素或地高辛的间接标记，也有FITC或者罗丹明对探针分子的直接标记。第10页,共29页，2024年2月25日，星期天探针标记方法比较敏感性：放射性探针＞地高辛探针＞生物素探针对人危害性：放射性探针、生物素探针放射性探针受半衰期限制，不可长期保存。生物素探针受内源性生物素影响，可致假阳性；地高辛探针则显色复杂。第11页,共29页，2024年2月25日，星期天探针标记方法探针标记方法很多，大致分为：引入法和化学修饰法。*引入法：运用标记好的核苷酸来合成探针；*化学修饰法：采用化学方法将标记物掺入已合成的探针分子中去，或改变探针原有的结构，使之产生特定的化学基团。第12页,共29页，2024年2月25日，星期天引入法较化学修饰法更常用，按其整合的方法不同，引入法分为：*缺口平移法*随机引物法*末端标记法*PCR扩增标记法*RNA体外转录法第13页,共29页，2024