噬菌体及其研究进展.ppt

简介第22页,共32页，2024年2月25日，星期天利用荧光素酶基因作为报告基因的快速检测技术对于细菌来说，发光机理可用下式表述：FMNH2+RCHO+O2→FMN+H2O+RCOOH+hν(490nm)反应是在荧光素酶的催化下进行的。细菌的荧光素酶是一个77kD的二聚体，其中包含α亚基(4037kD)和β亚基(37kD)。目前，生物发光基因(lux,luc)在报告噬菌体检测技术中应用最为广泛。Waddell等利用转座子致突变，将lucA和lucB基因插入到E.coliO157:H7的温和噬菌体φV10中，构建了一个荧光素酶转座噬菌体，这一噬菌体能够使E.coliO157:H7在1h内被成功检测，并报告出结果。Masahito等将绿荧光蛋白(GFP)基因分别插入到T偶数型噬菌体PP01的外壳蛋白(SOC)基因的C末端和N末端，构建成噬菌体PP01-GFP/SOC和PP01-SOC/GFP，这种对E.coliO157:H7特异的噬菌体能够成功检测菌体的可培养细胞，不可培养但可存活细胞(VBNC)及经过巴氏消毒过的细胞，灵敏度高，检测时间仅为20min。第23页,共32页，2024年2月25日，星期天以β-半乳糖苷酶作为报告基因的快速检测技术β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)是一种催化β-半乳糖苷水解反应的糖苷酶。β-半乳糖苷酶的作用特性是随着水解反应底物的不同而改变，邻硝基苯β-D-半乳糖苷是检测中常用的灵敏基质，它被β-半乳糖苷酶水解后产生蓝色沉淀，该技术可以使检测的灵敏度达到生物发光荧光素酶检测的水平。Goodridge等设计了一个带有lacZ基因的T4噬菌体，用这种噬菌体感染待测样品，并用化学发光基质作为检测基质，研究人员成功检测了肉汤培养基中的E.coli，检测限仅为102CFU/ml。然后，研究人员将最大概率数(mostprobablenumber，MPN)法应用到食源性病原菌检测中，检测水平可降至10CFU/ml，用时仅1h。第24页,共32页，2024年2月25日，星期天3、噬菌体在食品产业中的应用食源性疾病病原的检测技术作为食品添加剂噬菌体展示技术检测真菌毒素第25页,共32页，2024年2月25日，星期天3.2作为食品添加剂美国食品和药物管理局批准了一种由噬菌体病毒混合而成的产品，主要用于杀灭肉制品中的李氏杆菌。这是美国首次批准将病毒用作食品添加剂。美药管局专家称，该产品在制备过程中可能留有残毒，但试验表明，这些微量的残毒不会引起任何健康问题。该产品包含6种噬菌体病毒，可在熟肉片和香肠等包装前喷洒在这些肉制品上，有效杀灭多种李氏杆菌，预防由这些细菌引起的食物中毒。产品中所包含的噬菌体只会攻击李氏杆菌，对人体和植物细胞都不会产生影响。第26页,共32页，2024年2月25日，星期天3、噬菌体在食品产业中的应用食源性疾病病原的检测技术作为食品添加剂噬菌体展示技术检测真菌毒素第27页,共32页，2024年2月25日，星期天3.3噬菌体展示技术检测真菌毒素噬菌体展示技术(Phagedisplaytechnology)是20世纪80年代逐步建立并发展起来的一项分子生物学新技术。它以噬菌体或噬粒为载体,使外源肽或蛋白基因与噬菌体表面特定蛋白基因在其表面进行融合表达,进而通过亲和富集法筛选表达有特异肽或蛋白质的噬菌体。第28页,共32页，2024年2月25日，星期天真菌毒素作为天然毒素广泛存在于谷物等食品中，世界很多国家均有被污染的报告，由于真菌毒素属于痕量污染物，因此检测技术主要有各类色谱法和利用抗体的免疫学方法。其中高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱和质谱联用（GC-MS）优点：灵敏度和可靠性都很高缺点：样品处理繁琐，仪器昂贵，现场快速检测中难以普及使用酶联免疫吸附检测技术(ELISA)优点：可以同时大批量检测样品，携带方便，操作简便和经济,常以试剂盒的形式出现且易商品化缺点:目前用于ELISA检测试剂盒的各类毒素的单克隆抗体(McAb)主要来源于小鼠杂交瘤细胞，在筛选单克隆抗体生产杂交瘤细胞株系上，需要做杂交融合，亚克隆筛选，是一个长期复杂的过程，既耗费财力、物力，又浪费时间，且检测所用真菌毒素标准品价格昂贵。第29页,共32页，2024年2月25日，星期天利用噬菌体展示技术制备抗体、模拟抗原表位，不仅绕过了细胞融合，而且可以以单克隆抗体（McAb）或单链抗体（ScFv）为靶分子筛选真菌毒素的模拟抗原表位，代替真菌毒素的标准品，建立无毒ELISA检测方法，保证实验操作人员