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His-tag重组蛋白纯化方法
【基本试剂】
1.Luria-Bertani(LB)mediumperlitre:10gtryptone(Oxoid),5gyeastextracts(Oxoid),5g
NaCl.AdjusttopH7.2withNaOH.Autoclaveandstoreat4°C.
2.IPTG,100mMstock:dissolve2.38gIPTGin100mLdeionisedwater.Filtersteriliseandstore
at−20°C.
3.Glucose:20%(w/v)D-glucosesolutionindeionisedHO.Autoclaveandstoresterilesolution
2
atroomtemperature.AddglucosetoLBmediumwithantibioticstoafinalconcentrationof
0.5-1%.
4.NativeSolutions：
A.Lysisbuffer(1L):50mMNaH2PO4;6.90gNaH2PO4·H2O(MW137.99g/mol),300mM
NaCl;17.54gNaCl(MW58.44g/mol),10mMimidazole;0.68gimidazole(MW68.08g/mol).
AdjustpHto8.0usingNaOH.Ifthetaggedproteindoesnotbindundertheseconditions,the
amountofimidazoleshouldbereducedto1-5mM.
B.Nativewashbuffer(1L):50mMNaH2PO4;6.90gNaH2PO4·H2O(MW137.99g/mol),300
mMNaCl;17.54gNaCl(MW58.44g/mol),20mMimidazole;1.36gimidazole(MW68.08
g/mol).AdjustpHto8.0usingNaOH.
C.Nativeelutionbuffer(1L):50mMNaH2PO4;6.90gNaH2PO4·H2O(MW137.99g/mol),
300mMNaCl;17.54gNaCl(MW58.44g/mol),250mMimidazole;17.00gimidazole(MW
68.08g/mol).AdjustpHto8.0usingNaOH.
5.IMACresin(e.g.,Ni-NTAAgarose,QIAGEN,Cat.#30210;NiSepharoseHP,GEHealthcare,
Cat.#17-5318-01;orNi-NTAHis•BindResin,Novagen,Cat.#70666-4).
【重组蛋白纯化步骤】
一、重组蛋白的诱导表达
1、将阳性克隆接种至5mL液体LB培养基中，置于摇床中200rpm/37°C培养12h。
Kanamycin（Kan）终浓度为50µg/mL；Ampicillin（Amp）终浓度为100µg/mL。
2、将过夜培养的菌液以1:100接入300mL液体LB培养基中，置于摇床中200rpm/37°C
培养约1.5-2h，测定菌液的OD595值。当OD595达到0.5-0.8时，取1mL菌液，4000×g离
心去除上清，并将沉淀的菌体冻存于−80°C。
3、同时，在剩余的菌液中加入终浓度为0.2mM的IPTG，并继续将菌液
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