(7.9)--Southern杂交细胞生物学.doc

Southern杂交

用适当的内切酶完全酶解约20μg植物总DNA。65oC处理10分钟终止酶切反应。

酶解产物在1×TAE琼脂糖凝胶中，30V电压电泳5小时。（Marker:40ngperlane）

电泳后切去胶周围无用部分，0.25mol/LHCl处理10分钟脱嘌呤。

用2×SSC进行中和。

按Sambrook等(1989)的方法，用0.4mol/LNaOH进行转膜24小时。

2×SSC中和10分钟。

在杂交管中加入适量预热的预杂交液，小心将膜放入，排除气泡。

65oC预杂交3-5小时；

倒出预杂交液，加入5-10ml预杂交液及标记好的探针，65oC杂交16~24小时。

依次用洗膜液I、II、III、IV进行洗膜，每次约10-15分钟(根据信号强弱作适当调节)。

将膜放在滤纸上晾干，用保鲜膜包好；

暗室中压片，-20oC下曝光2-7天(曝光时间依信号强弱而调节)。

冲洗X光片（显影2~5min,定影20min），观察杂交信号的情况。

每次杂交后可用下述溶液依次处理，去除旧探针，硝酸纤维素膜即可反复使用。

A：0.1mol/LNaOH,20min；

B：0.1mol/LTris.HCl(pH7.5),0.1×SSC,0.1%SDS,10min；

C：0.1×SSC,0.1%SDS,10min。

Note:去除膜上探针：

※适用于DNA和RNA杂交:0.5%SDS煮沸，放入膜逐渐凉至室温

※仅适用于DNA杂交:膜在0.4mol/LNaOH中45oC30min,然后0.1×SSC,0.1%SDS,0.2mol/LTris.HCl(pH7.5),15min。

DNA点杂交

将样品DNA点在尼龙膜凹面上，每点DNA约5μg左右；

晾干后，将膜漂浮在NaOH变性溶液中，有DNA的那面朝上，变性10min；

在2×SSC溶液中中和5min。（以下同Southern杂交7-13步）

探针的制备

煮沸变性DNA片段10分钟；

快速取出，冰浴10分钟；

依次加入下列试剂：

1kbMarkerDNA(2ng/μL) 2μl

或双酶切marker（8ng/ul） 1ul

模板DNA(25ng/μL) 2μl

引物(Hexanucleotidemixture) 1μl(0.75ug)

dNTP(10mmol/L)(不含dCTP) 1μl×3

α-32PdCTP 2μl

Klenow 1μl

Klenowbuffer 2ul

H2O xμl

总体积 20μl

37oC水浴1-2小时；

等体积0.4NNaOH中变性5-6分钟。

试剂配制

20xSSC:800ml水中溶解175.3gNaCl(3M)和88.2g(0.3M)柠檬酸钠，加水定容为1L,加入数滴10MNaOH调pH值至7.0。(263gNaCl和132.3g柠檬酸钠为1.5L)

预杂交液： 100ml

5xSSC 25ml20xSSC

0.1%月桂酸钠(N-Lauroylsarcosine)0.1g

0.02%SDS0.2ml10%SDS

1%封闭剂(Blockingreagent)1g

74mlddH2O

变性(转膜)液： 1mol/LNaCl 58.4g

0.4mol/LNaOH 16g/L

中和液： 1.5mol/LNaCl 44g

0.5mol/LTris.ClpH7.2 30.275g约20ml浓HCl

0.001MEDTA0.5MEDTA1mlper500ml

0.25NHCl:4.20ml浓HClper200ml

洗膜液：I:2xSSC+0.1%SDS; 20ml20xSSC,1ml20%SDSper200ml

II:1xSSC+0.1%SDS;

III:0.5xSSC+0.1%SDS; 10ml20xSSC,2