核酸的分离与纯化技术.pptx

第三章核酸的分离纯化技术

临床样本处理与分离纯化技术1临床样本的处理2DNA的分离与纯化3RNA的分离与纯化4自动化分离纯化系统

第一节临床样本的处理核酸是由核苷酸或脱氧核苷酸通过3’,5’—磷酸二酯键连接成的一类生物大分子，包括核糖核酸RNA和脱氧核糖核酸DNA两类。真核生物原核生物染色体DNA（细胞核内，双链线状）细胞器DNA（线粒体或叶绿体，双链环状）染色体DNA（双链环状）质粒DNA

一、临床样本处理的一般原则（一）样本的采集生理活性物质容易失活与降解，采集时要保持取材的新鲜，防止腐败、变质与微生物的污染，按照所需样本的取材时间进行采集，根据不同类型的疾病、病程的不同阶段以及检测方法的要求，收集相应的临床标本，最大限度保证检测结果的可靠性。第一节临床样本的处理

（二）样本的运送样本采集后，应尽快送至实验室检测，建议大多数样本采集后在2~8℃的低温条件下运送。（三）样本的保存对于不能及时检测的样本，DNA样本可在2~8℃下保存一周，RNA和蛋白质样本可在-20℃下短期冻存，长期不用的样本可以-70℃或液氮中保存。第一节临床样本的处理

二、常见临床标本的处理方法1.血液：分子生物学检验中常见的临床样本，采集前应考虑饮食、药物、采集时间等因素的影响，取样时应避免溶血和产生泡沫。包括血清、血浆、全血、血细胞和无蛋白质的血滤液等。2.体液：尿液、脑脊液、关节积液、浆腔膜积液等，离心后收集沉淀用于核酸提取。3.组织：术后脏器、组织等新鲜材料应迅速剥离脂类和结缔组织，用生理盐水冲洗干净备用。第一节临床样本的处理

4.细胞：贴壁生长细胞和悬浮细胞。5.痰液：去除黏蛋白和其他杂质。6.棉拭子：呼吸道、消化道和生殖道等标本的采集。7.特殊样本：带毛囊的毛发、唾液、牙刷、口香糖、烟蒂、口杯、鼻血、精斑、指甲等。第一节临床样本的处理

三、组织细胞的破碎第一节临床样本的处理破碎细胞机械法非机械法液体剪切法固体剪切法干燥法溶胞法：化学试剂、酶（方法温和）不适合真核基因组DNA

第二节DNA的分离与纯化临床检验中的DNA样本包括真核生物DNA、细菌DNA、质粒DNA、病毒DNA等，结构上有双链环状、双链线性和单链环状。DNA的分离与纯化要遵循保证DNA一级结构的完整和防止被RNA、蛋白及其他分子污染的原则。简化操作步骤，尽量减少对DNA的破坏。

一、基因组DNA的分离与纯化第二节DNA的分离与纯化（一）酚-氯仿抽提法以含EDTA、SDS和RNA酶的裂解缓冲液裂解细胞，蛋白酶K消化蛋白，然后用酚-氯仿抽提DNA，最后乙醇或异丙醇进行沉淀。获DNA大小为100-150kb。

第二节DNA的分离与纯化主要试剂的作用EDTA：1.二价金属离子螯合剂，抑制DNA酶活性；2.降低细胞膜的稳定性。

第二节DNA的分离与纯化SDS：阴离子去垢剂1.溶解膜蛋白和脂肪，从而使细胞膜破裂；2.溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸释放出来；3.与蛋白质形成复合物，使蛋白质变性；4.对RNA、DNA酶有抑制作用。

第二节DNA的分离与纯化蛋白酶K：广谱蛋白酶水解蛋白质的作用，消化DNA酶和细胞中的蛋白质。蛋白酶K与其他蛋白酶相比，它具有更强的水解能力，而且在SDS、EDTA存在时仍保持较高活性，可同时使用。

第二节DNA的分离与纯化无DNA酶的RNA酶可以有效水解RNA，而避免DNA的消化；酚可以使蛋白质变性沉淀、抑制DNA酶活性。在酚或酚-氯仿中加入少许的异戊醇，是可以减少实验中的气泡的产生，而且利于分相，保持分相的稳定性。

第二节DNA的分离与纯化

第二节DNA的分离与纯化酚-氯仿抽提法——流程示意图

第二节DNA的分离与纯化能有效变性蛋白质，并抑制了DNA酶的降解作用采用实验室常见的试剂和药品，成本低。苯酚和氯仿毒性较大，DNA回收率较低，不能进行微量操作。

第二节DNA的分离与纯化（二）吸附柱法硅基质材料吸附核酸的原理：主要利用DNA在高盐低pH值环境下与硅基质材料相结合，在低盐高pH值环境下与硅基质材料脱离的特征。其机理可能是高浓度盐离子破坏了硅基质水分子结构，形成阳离子桥，当盐被清除后，再水化的硅石破坏了基质和DNA之间的吸引力，因而DNA从硅基质上被洗脱下来。

第二节DNA的分离与纯化

第二节DNA的分离与纯化

第二节DNA的分离与纯化（三）磁珠法磁珠法的原理是采用纳米级磁珠，表面标记了对DNA有吸附作用的特定活性官能团，能同DNA发生吸附，通过洗涤液洗涤后，加入洗脱液DNA释放于洗脱液中。同时可以利用磁珠的磁性可以实现定向移动和聚集，不用离心就可以