PCR技术-教学课件.pdfVIP

北京科技大学

环境工程

微生物学

李冰副教授

PCR技术

PCR技术

PCR(polymerasechainreaction)又称聚合酶链反应，该技术是

近年来分子生物学领域中迅速发展和广泛应用的一种技术。PCR

技术能快速、特异地在体外扩增所希望的目的基因或DNA片段，

是基因扩增技术的一次重大革新，它可以将极其微量的DNA特异

地扩增上百万倍。

◼1985年，美国Cetus公司的Mullis等人建立了一套大量快速地扩增

特异DNA片段的系统，获得了大量染色体DNA单拷贝基因；

◼1988年，由于在PCR系统引入了热稳定的TaqDNA聚合酶

(从水生嗜热菌Thermusaquaticus中提取的耐热DNA聚合酶)，

实现自动多次循环；

◼1993年，Mullis由于这项工作，获得了诺贝尔奖。

PCR技术

优点PCR检测速度快，只需5～6h出结果。

环境中存在各种生物的DNA，量少。采集到少量

DNA，加入引物和DNA多聚酶，采用PCR技术，

可在体外扩增至足以供检测、鉴定所需的用量。

应用法医鉴定、医学、卫生检疫、环境检测等方面。

举例1）法医在某处找到死者的骨骼，从骨骼中提取少

量DNA，用PCR技术在体外扩增某一DNA片段就

可鉴定出死者的身份。

2）用PCR技术鉴定在土壤、水中、污(废)水处理

系统和固体废物处理系统中的微生物。

PCR技术的基本步骤

（1）变性

将待扩增的DNA置于94～95℃的高温水浴中加热5min，使双链DNA

解链为单链DNA，分开的两条单链DNA作为扩增的模板。

（2）退火

将加热变性的单链DNA溶液的温度缓慢下

降至55℃，在这过程中将引物DNA的碱基与单

链模板DNA一端碱基互补配对。

（3）延伸

退火过程中，当温度下降至70℃时，在耐

热性TaqDNA多聚酶、适当的pH和一定的离子

浓度下，寡核苷酸引物（引物DNA）碱基和模

板DNA结合延伸成双链DNA。

PCR技术的基本原理

PCR是通过温度控制来实现，每次“热变性-退火-延伸”的过程为一

个周期，称为一个PCR循环。

◼将待扩增DNA模板加热变性、解旋，两链分

开成两条单链；

◼在退火温度条件下，用两引物--ssDNA（可

设计的、含18～24个核苷酸、与待扩增核酸

片段两端互补的单链DNA片段）同模板杂交；

◼在TaqDNA聚合酶、4dNTPs(dATP，dCTP，

dGTP和dTTP)、Mg2+和合适pH缓冲液存在

的条件下，两引物的3′端相对，5′端相背，

扩增的片段由5′端向3′端延伸引导DNA合成。

PCR全过程

PCR全过程实质是在适当条件下PCR循环1cycle=2Amplicon

（热变性-复性-延伸）的多次重复。一般进行2cycle=4Amplicon

25～40个循环。3cycle=8Amplicon

首次PCR中延伸的产物在进入第二次循环变4cycle=16Amplicon

性后，再与引物互补，充当引导DNA合成的新模

板。因此，第二轮循环后，模板由首轮循环后得5cycle=32Amplicon

到的4条增为8条（包括原始模板在内），依次类