免疫组化的原理与操作.ppt

(2)双桥法在三抗之后，将二抗和三抗再重复一次，可增大染色强度。★特别提示：注意动物种属关系特点：敏感性高，但酶浓度不好掌握；与组织非特异性结合的酶不易洗去，背景染色重。第21页,共39页，2024年2月25日，星期天4．过氧化物酶—抗过氧化物酶法（Peroxidaseanti-peroxidasemethod，简称PAP法）是桥法的改良，用第二抗体作“桥梁”，先与第一抗体结合，再与PAP复合物联结，形成抗原—抗体—抗IgG抗体—PAP复合物，最后用底物显色剂显色。特点：灵敏度高，比间接荧光法敏感20倍，比间接酶标记抗体法敏感100倍第22页,共39页，2024年2月25日，星期天5．亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法（avidin-biotin-peroxidasecomplextechnique，简称ABC法）。关键的程序步骤为3步：Ag+Ab1+（Ab2-B）+AB★C复合物（Ab2-B为生物素标记的第二抗体）（B★为生物素标记的过氧化物酶）AB★C复合物是avidin与酶联biotin在使用前30min配置，混匀。1个avidin分子结合了3个biotin分子，剩下1个结合点与2抗的生物素结合，avidin起桥联作用。第23页,共39页，2024年2月25日，星期天（1）ABC复合物的制备：（2）ABC法反应原理：特点：ABC法敏感性更高，比PAP法敏感20~40倍，背景也更清晰。第24页,共39页，2024年2月25日，星期天ABC法示意图第25页,共39页，2024年2月25日，星期天染色结果观察（BrdU）第26页,共39页，2024年2月25日，星期天6、酶标亲和素-生物素技术（labelledavidin-biotintechnique，简称LAB法）。即用辣根过氧化物酶直接标记avidin，用biotin标记2抗。关键步骤为3步：Ag+Ab1+（Ab2-B）+A★（A★为HRP标记的卵白素）A★与2抗的生物素结合，avidin起桥联作用。如将该法中的卵白素（avidin）变换成链霉卵白素(streptavidin)，LAB法即成LsAB法，或称SP法。据认为LAB法比ABC法敏感2~4倍，而LsAB法因链霉卵白素不与组织细胞中内源性生物素结合而特异性更高。现在SP法已趋于取代ABC法而广为应用。第27页,共39页，2024年2月25日，星期天生物素化Ⅱ抗AB复合物酶标链卵白素AvidinBiotinPeroxidaseⅠ抗组织抗原ABC法（3步完成）LsAB（SP）法（3步完成）第28页,共39页，2024年2月25日，星期天链霉卵白素酶生物素底物抗原SP法示意图第29页,共39页，2024年2月25日，星期天（二）免疫组化染色步骤（以ABC法为例）

1)、切片常规脱蜡至水：二甲苯虽然可以反复使用，但次数不宜多。乙醇的浓度是从高到低，与脱水时相反。

2)、灭活内源性酶：博士德推荐应用3%的双氧水，但实际操作中，使用30%双氧水和纯甲醇按1:9的溶剂比混合较为理想。

3)、抗原修复：暴露被交联封闭的Ag。

4)、正常山羊血清封闭：封闭时应该注意室温与时间的相对关系。室温低，时间就要长一些，反之亦然。另外，保持反应池湿润是重要的一环，否则，前功尽弃。后面的步骤也是如此。

5)、一抗反应：一抗的稀释度、孵育时间和温度与染色强度与背景有直接关系。一般说来，阳性染色强度不够时，可提高一抗浓度和延长孵育时间；背景过高时则相反。

孵育时间与温度：抗原抗体充分反应是得到可靠结果的关键。因此，控制温度与时间也是一个严肃的问题。由于室温控制较为困难，建议4℃冰箱过夜（≥18h）。第30页,共39页，2024年2月25日，星期天6)、二抗（生物素化IgG）反应：建议湿盒内37OC1h，另外仪器显示温度37℃，但实际只有23℃，自然结果难以令人满意。

7)、SABC染色（37℃）：这是博士德的人性化之处，直接就可以用。

8)、DAB显色镜下控时：DAB浓度应该比推荐的要低一些，这样可以便于控制反应时间以及在合适的时候中止反应。同时注意，使用后残余的DAB应妥善处理，而不是随便倒入下水道，因为它有致