分子生物学常用检测技术.ppt

PCR反应体系Mg2+Mn2+dCTPdGTPdTTPdATPTaqDNA聚合酶模板引物和或和（二）PCR反应的设计及影响因素第9页,共30页，2024年2月25日，星期天PCR的种类荧光定量PCR通用引物PCR多重PCR巢式PCRRT-PCR原位PCR免疫PCR……第10页,共30页，2024年2月25日，星期天TaqMan探针reverseprimerRQforwardprimer33553551.PolymerisationprobeRQ33553552.StranddisplacementQ33553553.CleavageR3553554.PolymerisationcompletedQRR=ReporterQ=Quencher3荧光定量PCR第11页,共30页，2024年2月25日，星期天定量PCR的数学原理PCR理论方程N=N0x(1+E)nN：扩增数量N0：起始模板数量E：扩增效率N：循环数Log[DNA]循环数线性增长期Linear平台期Plateauy=N0(1+e)n指数增长期Geometric第12页,共30页，2024年2月25日，星期天定量PCR的数学原理Rn(荧光强度)循环数CycleNumber指数增长期平台期CT=-klogN0+bCt?（Cyclethreshold）值：是指每个反应管内的荧光信号到达设定域值（threshold）时所经历的循环数。第13页,共30页，2024年2月25日，星期天PCR的临床应用对病原微生物核酸进行快速检测弥补免疫检测的缺陷缩短诊断的窗口期（如HBV,HIV）用于药物疗效监测和评估用于肿瘤基因表达方面的研究用于遗传病的诊断第14页,共30页，2024年2月25日，星期天样本采集要求第15页,共30页，2024年2月25日，星期天第16页,共30页，2024年2月25日，星期天二、核酸分子杂交根据核酸变性和复性的原理，不同来源的变性单链核酸分子在合适的条件下，通过碱基互补形成双链杂交体的过程称为核酸分子杂交（molecularhybridization）。第17页,共30页，2024年2月25日，星期天1、遗传病的诊断2、病原体的鉴定3、癌基因突变的检测4、组织配型5、亲子鉴定核酸分子杂交的临床应用第18页,共30页，2024年2月25日，星期天三、基因芯片技术基质材料分，有尼龙膜、玻璃片、塑料、硅胶晶片、微型磁珠等。第19页,共30页，2024年2月25日，星期天用点样法固定在玻璃板上的DNA探针阵列原位合成法在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷酸探针阵列第20页,共30页，2024年2月25日，星期天基因芯片技术的应用1、药物筛选和新药开发2、疾病诊断3、环境保护4、司法5、现代农业第21页,共30页，2024年2月25日，星期天四、测序技术CTTGATCTTCAGGTAGGCCTGAATCCT（一）一代测序技术第22页,共30页，2024年2月25日，星期天（二）二代测序技术Illumina公司的Solexa和Hiseq应该说是目前全球使用量最大的第二代测序机器，这两个系列的技术核心原理是相同的。Illumina/SolexaGenomeAnalyzer测序的基本原理是边合成边测序。在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。第23页,共30页，2024年2月25日，星期天第24页,共30页，2024年2月25日，星期天技术特点比较第一代测序技术的主要特点是测序读长可达1000bp，准确性高达99.999%，但其测序成本高，通量低等方面的缺点，严重影响了其真正大规模的应用。第二代测序技术大大降低了测序成本的同时，还大幅提高了测序速度，并且保持了高准确性，但在序列读长方面比起第一代测序技术则要短很多。第25页,共30页，2024年2月25日，星期天五、基因重组技术基因重组是指一个基因的DNA序列是由两个或两个以上的亲本DNA组合起来的。基因重组是遗传的基本现象，病毒、原核生物和真核生物都存在基因重组现象。第26页,共30页，2024年2月25日，星期天转基因植物（抗虫、抗冻、抗