克隆载体的特征及类型.ppt

质粒重要的大肠杆菌质粒载体pGEM-3Z：多拷贝装有两个噬菌体的强启动子装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记lacZ’用于外源基因的高效表达注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合2743bpMCSlacZ’PT7oriAprpGEM-3EPSP6酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如：E.coliBL21（DE3）等第32页,共59页，2024年2月25日，星期天在重组的pGEM3Z载体中加入相应的RNA聚合酶，可以发生外源基因转录。第33页,共59页，2024年2月25日，星期天质粒载体总体评价操作简便克隆容量有限（10kb）第34页,共59页，2024年2月25日，星期天第二节噬菌体或病毒DNA噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来。高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增第35页,共59页，2024年2月25日，星期天噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的l噬菌体DNAl噬菌体的生物学特性：生物结构l噬菌体由外壳包装蛋白和l-DNA组成l-DNA全长48502个核苷酸l-DNA上至少有61个基因约有20kb的区域为为噬菌体生长非必需的，可以缺失或被外源DNA片段所取代。第36页,共59页，2024年2月25日，星期天l噬菌体生物学特性：生物结构5’TCCAGCGGCGGGG3’3’CCCGCCGCTGGA5’COSCOScos头部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因晚期控制基因DNA合成控制基因阻遏基因早期控制基因阻遏基因重组基因删除与整合基因l-DNA黏性末端第37页,共59页，2024年2月25日，星期天噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的l噬菌体DNAl噬菌体生物学特性：感染周期E.coli吸附LamB受体注入复制包装裂解第38页,共59页，2024年2月25日，星期天噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的l噬菌体DNAl噬菌体生物学特性：感染周期体内包装100个左右的拷贝包装范围为原DNA的75-105%即36-51kbDA第39页,共59页，2024年2月25日，星期天噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的l噬菌体DNAl噬菌体生物学特性：溶原状态l噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上，并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态。人们可以根据需要改变l-DNA或宿主细胞的性质，使噬菌体或处于溶菌状态，或处于裂解状态DNA重组技术一般需要l噬菌体进入溶菌状态第40页,共59页，2024年2月25日，星期天噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的l噬菌体DNAl-DNA载体的构建：缩短长度野生型l-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型l-DNA的长度，可以提高装载量。其实野生型l-DNA上约有40-50%的片段是复制和裂解所非必需的。根据切除的多少，可将l-DNA分成两大类载体：插入型载体取代型载体第41页,共59页，2024年2月25日，星期天噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的l噬菌体DNAl-DNA载体的构建：缩短长度插入型载体体外包装插入位点体外包装插入片段载体长度37kb插入片段大小：0-14kb（51–37）重组与否均可包装，因而为区分重组子与非重组子必须携带标记基因。第42页,共59页，2024年2月25日，星期天噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的l噬菌体DNAl-DNA载体的构建：缩短长度取代型载体体外包装体外包装插入片段最小装载长度10kb（51–26）载体长度26kb插入片段最大装载长度25kb（36–26）第43页,共59页，2024年2月25日，星期天噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的l噬菌体DNAl-DNA载体的构建：删除重复的酶切位点野生型的l-DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII位点，不利于重组操作，必须删除至1-2个同时，为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增加一些单一的酶切位点除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增添酶位点第44页,共59页，2024年2月25日，星期天噬