免疫组化各步原理.pdf

）技术是用标记的

特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测

技术。目前，这种技术在临床病理诊断和形态学研究中已得到广泛应用。

（一）、免疫组化常用染色方法和步骤（石蜡切片）

SP法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法）:

法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法）原理采用生物素标记的第二

抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及底物色素混合液来测定细胞和

组织中的抗原。

主要步骤:

主要步骤1、石蜡切片脱蜡（与常规HE切片脱蜡相同）：石蜡切片置60℃烤箱

烤片15小时以上一从烤箱中拿出立即放入二甲苯I中5~10min一二甲苯II

5~10min一无水乙醇5min一95%乙醇5min一80%乙醇5min一70%乙醇

5min一自来水洗

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2、3%H2O2阻断20min（以消除内源性过氧化物酶的活性，降低背景）；PBS

洗3次，每次5min。3、抗原修复；PBS洗3次，每次5min。4、滴加5~10%正

常山羊血清封闭，37℃,10min（消除背景非特异性着色）

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5、吸干组织周围多余的血清，不洗，滴加第一抗体，37℃,孵育60min或孵育30min

再4℃冰箱过夜；PBS洗3次，每次5min。6、擦干组织周围PBS,滴加生物素

标记的第二抗体，37c孵育20min,PBS洗3次，每次5min。

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7、擦干组织周围PBS,滴加链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液37c孵育20min。

8、PBS洗3次，每次5min,D.W洗2次，DAB显色（DAB必须现用现配），

镜下控制显色程度，自来水冲洗，苏木素复染胞核，烤干，中性树胶封片。

染色步骤:

染色步骤石蜡切片脱蜡到水；3%H2O2阻断10min（以消除内源性过氧化物

酶的活性，降低背景）；蒸馏水洗2次，PBS洗3次，每次5min。抗原修复；

PBS洗3次，每次5min；

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滴加第一抗体，37℃孵育60min或37℃孵育30min再4℃冰箱过夜；PBS洗3

次，每次3min。擦干组织周围PBS,滴加酶标抗鼠/兔聚合物,37℃,孵育

20min。

PBS洗3次，每次3min,D.W洗2次，DAB显色，镜下控制，自来水充分冲

洗，复染，烤干，中性树胶封片。

（四）抗原修复:

（四）抗原修复目的：1、甲醛固定过程中形成醛键而封闭部分抗原决定簇；

2、甲醛在保存过程中会形成羧甲基而封闭部分抗原决簇；

3、固定剂固定组织时，会使组织中蛋白与蛋白之间发生交联，也可能封闭抗原

决定簇。4、抗原决定簇被封闭之后,会影响抗原抗体的结合,因此在染色时需先

进行抗原修复，通过抗原修复，充分暴露抗原决定簇。使抗原抗体得以充分结

合。

、抗原修复液中的化学物质分子或离子与部分抗原决定

族结合产生化学反应，增加了细胞和组织的通透性，便于抗原抗体的充分结合。

2、高温可以使某些已封闭的抗原决定族得以重新暴露和修复。3、微波是一种

高频电磁波，可打开蛋白质之间的交联键，从而使抗原修复。

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抗原修复注意事项:

抗原修复注意事项1、应根据不同的抗原选择合适的修复方法。2、热处理后

应注意自然冷却，酶消化后要洗干净。3、防止切片干燥，特别是热修复时要防

止修复液蒸发而使切片干燥。

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4、注意形态学结构的改变和脱片问题：酶消化浓度过高，时间过长、温度过高

都可能导致组织的形态结构改变；热修复时间过长也可能导致形态学结构改变和

脱片。

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（五）常用溶液的配制1、0.01MPBS:磷酸二氢钠（NaH2PO4