分子克隆常用工具酶.ppt

****植物基因工程DNA和RNA的修饰酶核酸酶SI碱性磷酸酶磷酸激酶末端脱氧核苷酸转移酶甲基化酶第53页,共72页，2024年2月25日，星期天植物基因工程1）单链核酸酶SI功能： 降解ssDNA或ssRNA形成5’-磷酸末端的单或寡核苷酸片段。第54页,共72页，2024年2月25日，星期天植物基因工程应用：分析DNA：RNA杂交体结构（S1mapping）。确定内含子部位。切除DNA片段上的单链末端，形成平末端.切开cDNA合成过程中形成的发夹环在限制酶位点上产生小缺失第55页,共72页，2024年2月25日，星期天植物基因工程第56页,共72页，2024年2月25日，星期天植物基因工程Rnase和DNaseRNase-FreeDNase是一种DNaseI（核酸内切酶），可以降解双链或单链DNA。RNaseH：特异性地水解杂交到DNA链上的RNA磷酸二酯键，故能分解RNA/DNA杂交体系中的RNA链。该酶不能消化单链或双链DNA。RNaseA：广泛应用的核酸内切酶。对RNA有水解作用，但对DNA则不起作用。Rnase酶非常稳定，常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能使RNase完全失活。DEPC处理。第57页,共72页，2024年2月25日，星期天植物基因工程碱性磷酸酶功能：催化去除DNA、RNA上的5’端磷酸基团,从DNA片段上除去5’磷酸以防自身连接。用途：在DNA连接之前常用它处理克隆载体以防止载体自身连接。第58页,共72页，2024年2月25日，星期天植物基因工程CalfIntestinalAlkalinePhosphatase(CIAP)第59页,共72页，2024年2月25日，星期天植物基因工程磷酸激酶T4-多核苷酸磷酸激酶第60页,共72页，2024年2月25日，星期天植物基因工程第61页,共72页，2024年2月25日，星期天植物基因工程末端脱氧核苷酸转移酶功能：在一定条件下，催化将一个一个的脱氧核苷酸，沿着5’到3’加到DNA链的3’-OH末端。该过程不需要DNA模板，对双链、单链DNA都适用。经常用于人工粘性末端的构建。末端脱氧核苷酰转移酶(TDT)第62页,共72页，2024年2月25日，星期天植物基因工程甲基化酶 原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主DNA不被相应的限制酶所切割。Dam甲基化酶可在GAmTC序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基。受其影响的酶有BccllII、MbbooII等。Dcm甲基化酶识别CCmAGG或CCmTGG序列，在第二个胞嘧啶C的C5位置上引入甲基。受其影响的酶有EccooRIIII等第63页,共72页，2024年2月25日，星期天基因工程中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻的5′磷酸基和3′羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶Ⅰ合成双链cDNA分子或片段连接缺口平移制作高比活探针DNA序列分析填补3′末端Klenow片段DNA聚合酶I大片段具有完整DNA聚合酶I的5??3?聚合、3??5?外切活性，而无5??3?外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA3?末端标记等反转录酶合成cDNA替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3′羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基第64页,共72页，2024年2月25日，星期天植物基因工程思考题：载体构建的工具酶主要有那些类型？限制性核酸内切酶、同裂酶、同尾酶、宿主的限制与修饰。核酸内切酶命名原则、操作注意事项及产生星活性的原因、影响其酶活性的因素。T4DNA连接酶的性质及用途.Klenow酶的基本性质及用途。其他工具酶的用途。第65页,共72页，2024年2月25日，星期天练习题第66页,共72页，2024年2月25日，星期天1.一种DNA分子经三种限制酶完全酶切后得如下结果：EcoRI5kbEcoRI/HindIII1、2、3、4kbHindIII3kb、7kbEcoRI/PstI