科域—细菌转化---8.9.pptx

细菌转化实验讲师：***博士

目录质粒的转化感受态细胞转化实验的基本步骤细菌转化的基本原理疑难解析

01质粒的转化1.1质粒转化的目的1.2质粒转化的步骤1.3外源DNA片段与载体的连接重组1.4限制性酶切位点的特征1.5插入外源基因

1.1.质粒转化目的放大某一基因片段，用于探针、基因功能检测等1携带目的基因的重组质粒在大肠杆菌中进行表达2PCR产物的克隆和测序3构建基因库、cDNA库4纯化基因片段5

外源DNA片段的获得3种方式：①PCR扩增出的基因组片段②cDNA③化学方法人工合成的DNA片段1.2.质粒转化的步骤

1.3.外源DNA片段与载体的连接重组可采用由HindIII切割开的pUC19质粒，用T4噬菌体DNA连接酶将PCR片段与切割开的质粒DNA片段重新连接成一个环状的DNA分子，即把目的基因DNA插入质粒DNA，实现了质粒重组。

限制性内切酶指能识别碱基构成特异的一段（4~8bp）双链核酸序列，并从中将核酸的磷酸二酯键断裂的一种蛋白酶。具有特异的识别核酸序列，称为酶切位点所有的限制性内切酶切割DNA均产生含5′磷酸基和3′羟基基团的末端。1.4.限制性酶切位点的特征

1.5插入外源DNA外源DNA和质粒是用同样的两个酶切，然后构建成含有外源基因的质粒质粒载体目标DNA

02感受态细胞

2.感受态细胞(CompetentCells)野生型E.coli不容易转化，通过化学等特殊方法处理E.coli细胞，改变其膜对DNA的通透性，这种细胞就称为感受态细胞，即细胞处于能摄入核酸分子时的生理状态。重组质粒野生型E.coli重组质粒短暂热刺激或电击CaCl2低温感受态细胞

03细菌转化的基本原理

3.细菌转化的基本原理转化：是指将质粒导入细菌内，以扩增质粒或在细菌内表达质粒所携带的基因转化方法热激法电击法

热激法示意图

3.1重组质粒的筛选与鉴定

3.2.重组质粒的筛选与鉴定半乳糖苷酶的蓝白斑筛选系统在质粒中含有LacZ基因的a-肽序列，当无外源DNA片段插入时，质粒表达a肽，它与宿主菌的LacZM15基因的产物互补，产生有活性的B-半乳糖苷酶，在含有指示剂X-gal和诱导剂IPTG存在的情况下，菌落呈蓝色（质粒自身环化）；在外源基因插入后LacZ基因的阅读框架被破坏，细菌内无半乳糖苷酶活性存在，菌落呈白色（阳性克隆）。

04转化实验的基本步骤

1）在两只无菌离心管上分别标记+DNA,-DNA。2）在上述两管中分别加入250μl转化液。3)迅速置于冰上。4）各挑取活化好的受体菌的一个单菌落，悬浮于两管转化液中。5）在标有+DNA的管中加入一环质粒DNA，而标有-DNA的管中不加。6）将上述两管于冰上放置10min。7）在准备好的培养基底部如左图。4.转化实验基本步骤

8）两只小管放入42℃水浴中处理50秒，再迅速放于冰上2min。9）在两只小管中分别加入250μlLB-肉汤。10）从+DNA小管中分别吸取100μl滴加在两个标有+DNA的平板上，从-DNA小管中分别吸取100μl滴加在两个标有-DNA的平板上。11）用无菌接种环将滴加的液体均匀涂布在平板上。12）将上述四只平板固定，并于42℃培养箱中培养2天。13）在长波紫外灯下观察结果，记录各平板上的菌落数

05疑难解析

①平板无菌落形成可能原因解决方法①用于转化的DNA是否降解②感受态失效③质粒抗性是否弄混④涂板时中操作部当①可通过琼脂糖凝胶电泳验证②重新制作感受态并转化③检查质粒抗体④涂板过程中必须严谨5.疑难解析

可能出现问题②菌落太多，无法挑取单克隆③菌落分布不均匀④平板上有杂菌⑤转化效率低可能原因①涂板时，未将菌液稀释②抗生素过期或者失效③感受态菌株被污染④多方面的原因解决方法①稀释菌液②重新倒平板③更换感受态④提高适度的DNA量⑤涂板时，玻璃棒冷却至室温⑥用电击法获得较高效率的转化效率

《细菌转化与细胞转染技术》系列