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;第十九章DNA复制、修复;第十九章DNA复制、修复;第十九章DNA复制、修复;第十九章DNA复制、修复;;复制的要点:
1半保留复制
2有起始点、终止点和方向
3半不连续复制;当细胞分裂,DNA进行复制时,双螺旋结构解开而成为单链,用于合成新的互补链。子代细胞出现新的DNA双链,其中一股单链是从亲代完整地接受过来的。另一股单链完全重新合成,且按碱基配对原则互补。;如果DNA全保留复制:新合成的子链全部进入子细胞;;;复制方向
复制方向大多数是双向的(等速进行或异速进行),形成两个复制叉,少数是单向复制,形成一个复制叉。;★用放射自显影实验判断DNA的复制方向及速度
a.单向
b.双向等速
c.双向异速;★环状DNA复制起点的genemappingP532;(一)、环式DNA复制
环状单链DNA,Φx174
(二)、D-环式
线粒体、叶绿体DNA
不对称复制,两条链的复制起点不在同一点上,一条链先复制,另一条链保持单链而被取代:当一条链复制到一定程度时才暴露出另一条链的复制起点,另一条链才开始复制。
;;?DNA聚合反应必备的条件:
1.底物dNTP(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)
2.聚合酶DNA聚合酶(DNA依赖的DNA聚合酶)DNA--pol
3.模板单链的DNA母链
4.引物寡核苷酸引物(RNA)
5.其他酶和蛋白质因子解链酶,解旋酶,单链结合蛋白,连接酶
;DNA聚合活性(5′→3′);DNA聚合酶的反应特点:
⑴以4种dNTP为底物
⑵反应需要接受模板的指导,不能催化游离的dNTP的聚合。
⑶反应需有引物3,-羟基存在
⑷链生长方向5,→3,
⑸产物DNA的性质与模板相同
;;(1)E.coli.DNApol.I(Kornberg)
单体酶,催化活性:
5,→3,聚合活性
3,→5,外切活性(校对)
5,→3,外切活性(修复)
用蛋白水解酶将DNApol.Ⅰ部分水解可得:
大片段(Klenow):5,→3,聚合活性、3,→5,外切活性。
小片段,36Kd,活性:5,→3,外切活性(只作用于双链DNA的碱基配对部分,切除修复)。;(2)E.coli.DNAPol.Ⅱ
单体酶,催化活性:
5,→3,聚合(活性很低)
3,→5,外切
可能在DNA的修复中起某中作用。
(3)E.coli.DNApol.Ⅲ
寡聚酶。
DNApol.Ⅲ是合成新链DNA主要的酶??又称复制酶(Replicase)
;DNA聚合酶催化的分子机制
来源于病毒、原核生物和真核生物的聚合酶、反转录酶甚至RNA聚合酶的聚合酶区域都有一个类似手指、手掌和拇指的基本结构,存在相似的折叠结构。;;
通过晶体结构和模型研究发现,
手指区域可与未复制的单链模板相互作用,同时手指区域的一部分也参与结合进入底物dNTP。
拇指亚区可与模板-引物DNA双螺旋相互作用。
聚合酶通过保守的氨基酸残基与引物模板复合物相互作用使引物的3’末端定位在手掌和手指的会合点,并与dNTP相对。;;研究还发现,dNTP的进入伴随着两个Mg2+离子的作用,由此提出了核苷酸加入(聚合)反应的双金属离子机制(twometal-ionmechanism)。
核苷酸的掺入是受模板指导的,所以DNA聚合酶在每个催化循环中都要改变它的核苷酸底物专一性。;DNA聚合酶的聚合反应的保真机制
dNTP的参入遵循碱基配对原则
DNA聚合酶3,→5,核酸外切酶活性校对机制
切除错配的碱基
核苷酸代谢库调节系统和修复系统
调节dNTPs的水平
切除修复、错配修复系统;DNA聚合酶III有6个结合位点
⑴模板DNA结合位点
⑵引物结合位点
⑶引物3,-OH位点、反应位点
⑷底物dNTP结合位点
⑸5,→3,外切位点
⑹3,→5,外切位点(校正)
;DNA聚合酶III的亚基组成;;;DNA复制过程:;1.解螺旋酶;2.单链DNA结合蛋白(SSB);3.DNA促旋酶;4.DNA连接酶(ligase);;DNA的双螺旋解开合成RNA引物的过程。
由拓扑异构酶松弛超螺旋,解螺旋酶解开双链,SSB(单链结合蛋白)结合到单链上使其稳定。
引发体:引物合成酶与各种蛋白质因子(dnaB、dnaC)构成的复合体,负责RNA引物的合成。
引发体沿着模板链3’→5’方向移动(与冈崎片段合成的方向正好相反,而与复制叉移动的方向相同),移到一定位置上即可引发RNA引物的合成。
引物的合成方向也是5′→3′方向。;;★大
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