分子生物学实验.ppt

关于分子生物学实验基因多态性多态性是指在一个生物群体中，同时和经常存在两种或多种不连续的变异型或基因型(genotype)或等位基因(allele)，亦称遗传多态性(geneticpolymorphism)或基因多态性。DNA片段长度多态性基因多态性DNA重复序列多态性单核苷酸多态性第2页,共18页，2024年2月25日，星期天DNA片段长度多态性(FLP)：即由于单个碱基的缺失、重复和插入所引起限制性内切酶位点的变化，而导致DNA片段长度的变化，又称限制性片段长度多态性。DNA重复序列的多态性(RSP)：主要表现于重复序列拷贝数的变异，如小卫星DNA和微卫星DNA。单核苷酸多态性(SNP)：即散在的单个碱基的不同，基因组中单核苷酸的缺失,插入与重复序列不属於SNP，但更多的是单个碱基的置换。第3页,共18页，2024年2月25日，星期天CLEC是Ctypelectin（C型凝集素）家族基因CLEC4M基因是19号染色体上C型凝集素家族中的一员，它被证明是多种传染性疾病病毒的受体，如HIV-1,SARS-Cov,HCV等。该基因的第4外显子的VNTR(VariableNumberofTandemRepeats，VNTR)在全球人类群体中存在3-9次重复的多态现象，并被认为这种不同长度的多态可能和宿主对病毒的易感性有关。第4页,共18页，2024年2月25日，星期天第5页,共18页，2024年2月25日，星期天CLEC4M与SARS体内存在一种SARS冠状病毒的受体L-SIGN，由CLEC4M基因所编码。该基因第4外显子存在3-9个69bp的重复片段，人群中超过50%的人以7个重复为主，常见的基因型为7/7，5/5，7/5等不同的纯合或杂合状态，这个重复区编码位于胞外受体的颈部。研究表明，纯合型如7/7或5/5的个体较杂合型7/5的个体较少感染SARS病毒。第6页,共18页，2024年2月25日，星期天CLEC4M基因序列第7页,共18页，2024年2月25日，星期天实验原理原理：用裂解液和蛋白酶K裂解口腔黏膜细胞，释放DNA，用浓盐法沉淀蛋白质，离心去除蛋白质，再用异丙醇沉淀DNA。裂解液配方：10mMTris-HCl，10mMKCl,10mMMgCl2,2mMEDTA,0.4MNaCl,1%SDS.第8页,共18页，2024年2月25日，星期天第9页,共18页，2024年2月25日，星期天2×PCRmixddH2O引物1，引物22×PCRmix10μl引物1，引物2各0.4μlddH2O6.2μlDNA样品3μlPCR反应体系，总共20μl第10页,共18页，2024年2月25日，星期天在PCR管盖上标记号码，便于辨认第11页,共18页，2024年2月25日，星期天放入PCR仪，并设置程序变性95℃5min95℃20s30循环59℃30s72℃45s延伸72℃5min第12页,共18页，2024年2月25日，星期天PCR过程大概100分钟第13页,共18页，2024年2月25日，星期天PCR仪器界面和参数第14页,共18页，2024年2月25日，星期天紫外透射分析第15页,共18页，2024年2月25日，星期天点样将PCR扩增产物加入琼脂糖凝胶孔内，点样量10μl第16页,共18页，2024年2月25日，星期天100bpDNAmarker，最亮的为500bp500bp杂合子，根据位置判断为589和727bp。杂带，分子量小，或是引物二聚体结果分析同学们，你们的基因是纯合还是杂合呢？第17页,共18页，2024年2月25日，星期天*感谢大家观看第18页,共18页，2024年2月25日，星期天