分子生物学研究方法.ppt

**因为绝大多数大肠杆菌细胞都会切除带有5-甲基胞嘧啶的外源DNA，所以实验中常选用mcrA-mcrB-菌株以防止cDNA被降解。**质粒载体和噬菌体类载体都能满足要求。**核酸杂交法以其广泛的适用性和快速性成为基因文库筛选中最常用的一种方法，**取出已经长有菌落的膜，用碱液处理，使菌落发生裂解，DNA随之变性。用蛋白酶K处理硝酸纤维素膜去除蛋白质，形成菌落DNA的印迹。80℃烘烤滤膜，将DNA固定在膜上。将滤膜与放射性标记的DNA或RNA探针杂交，通过放射性自显影显示杂交结果。通过对应于平板上的位置找到相应克隆。*****3、PCR筛选法菌落PCR检验菌液PCR检验分批检验法第105页,共114页，2024年2月25日，星期天*4、免疫筛选法该法仅适用于对表达文库的筛选。若实验中靶基因的序列完全未知但是有针对该基因产物的特异性抗体，就可以采用免疫筛选法。第106页,共114页，2024年2月25日，星期天*图6噬菌体表达文库的免疫化学筛选法示意图第107页,共114页，2024年2月25日，星期天*5.9RACE技术RACE(RapidamplificationofcDNAends)：在已知cDNA序列的基础上克隆5’端或3’端缺失序列的技术。一般分5’-和3’-RACE两种。已知cDNA序列可来自序列表达标签、减法cDNA库、差法显示和基因文库筛选。第108页,共114页，2024年2月25日，星期天*3’-RACE较简单，首先将mRNA或总RNA用PolyT引物反转录，根据一般基因具有polyA尾巴的特点，选用特异引物(根据已知序列设计)和PolyT引物PCR即可。5’-RACE相对较难，目前流行几种5’-RACE。其一为加接头(传统)，根据接头引物和自己设计特异引物PCR，可以设计巢式PCR二次扩增。另外，有利用反向PCR技术，连接成环再PCR。第109页,共114页，2024年2月25日，星期天*●Self-Ligation法5’RACE原理第110页,共114页，2024年2月25日，星期天*Adaptor-AddingMethod原理第111页,共114页，2024年2月25日，星期天*专题二：序列未知基因的克隆策略5.6构建基因组文库5.7构建cDNA文库5.8文库筛选5.9RACE第112页,共114页，2024年2月25日，星期天*部分考研题描述cDNA文库构建原理与方法（浙江大学2005，2006）科学家发现一种新的野生植物，如何制备相应的cDNA文库？（武汉大学2010）什么是基因文库和cDNA文库？如何构建？各有何特点？（华南理工2005）建立一个基因文库后，如何鉴定一个携带目的基因的克隆？（南京林业2004）第113页,共114页，2024年2月25日，星期天感谢大家观看第114页,共114页，2024年2月25日，星期天**分是指分离制备合格的待操作的DNA，包括作为运载体的DNA和欲克隆的目的DNA；切是指用序列特异的限制性内切酶切开载体DNA，或者切出目的基因；连是指用DNA连接酶将目的DNA同载体DNA连接起来，形成重组的DNA分子；转是指通过特殊的方法将重组的DNA分子送入宿主细胞中进行复制和扩增；选则是从宿主群体中挑选出携带有重组DNA分子的个体。****Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。四种dNTP浓度应相等，浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量。**DNA聚合酶（DNApolymeraseI）最早于1955年发现，而较具有实验价值及实用性的KlenowfragmentofE.Coli则是于70年代的初期由Dr.H.Klenow所发现，但由于此酶不耐高温，高温能使之变性,因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应。现今所使用的酶(简称Taqpolymerase),则是于1976年从温泉中的细菌（Thermusaquaticus）分离出来的。它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的酶，但它被广泛运用则于80年代之后。PCR最初的原始雏形概念是类似基因修复复制，它是于1971年由Dr.KjellKleppe提出。他发表了第一个单纯且短暂性基因复制（类似PCR前两个周期反应）的实验。而现今所发展出来的PCR则于1983由Dr.KaryB.Mullis发展出的，Dr.Mullis当年服务于PE公司，因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。Dr.Mullis并于1985年与Saiki等人正式发表了第一篇相关的论文。此后，PCR的运用一日千