DB42T 1679-2021副猪嗜血杆菌对替米考星的敏感性检测.pdfVIP

DB42/T1679—2021

副猪嗜血杆菌对替米考星的敏感性检测

1范围

本文件规定了副猪嗜血杆菌对替米考星的体外敏感性检测方法。

本文件适用于检测和判断兽医临床分离的副猪嗜血杆菌对替米考星的敏感性，合理应用替米考星

治疗副猪嗜血杆菌感染。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T34750副猪嗜血杆菌检测方法

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4仪器和设备

冰箱：2℃～4℃和-20℃。

恒温培养箱：37℃±1℃。

电子天平：感量0.00001g，0.001g，0.1g。

微量加样器：1μL～1000μL。

显微镜。

台式冷冻离心机。

细菌多位点接种仪。

生物安全柜：II级及以上。

5试剂或材料

替米考星标准品。

无支原体胎牛血清。

无菌96孔微孔板：带盖。

微孔滤膜：0.22μm。

无菌加样槽。

麦氏比浊管：0.5麦氏浊度。

1%辅酶I(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，NAD):准确称取0.01gNAD，用灭菌去离子水溶解并定容至

10mL，0.22μm滤膜过滤，配制成1%NAD。

胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)培养基:准确称取胰蛋白胨大豆琼脂8g，加188mL去离子水，摇匀,121℃

高压灭菌15min，冷至45℃左右，加入10mL无支原体胎牛血清和2mL1%NAD，混匀，配制成200mL

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TSA培养基。生物安全柜中，取20mL倾入无菌平皿，晾干。4℃保存备用。其他体积TSA培养基可按此

比例调整配制。

胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养基:准确称取胰蛋白胨大豆肉汤6g，加188mL去离子水，摇匀，

121℃高压灭菌15min，冷至45℃左右时加入10mL无支原体胎牛血清和2mL1%NAD，配制成200mL

TSB培养基。现配现用。其他体积TSB培养基，可按此比例调整配制。

替米考星标准储备液:按替米考星标准品纯度和比例准确称取替米考星标准品，放置于10mL容量

瓶中，添加甲醇并定容至10mL，-20℃避光保存。推荐替米考星储备液的范围为256μg/mL～2560μg/mL。

6细菌分离培养和鉴定

副猪嗜血杆菌的分离、鉴定和检测按照GB/T34750确定的方法和流程。

7体外敏感性检测

方法选择说明

副猪嗜血杆菌对替米考星的敏感性试验方法:琼脂稀释法（参见本文件7.2）和微量肉汤稀释法（参

见本文件7.3）。操作时任选其一即可。

琼脂稀释法

7.2.1菌悬液制备

细菌复苏于TSA培养基中，传代二次，挑取单菌落至TSB肉汤，振荡培养16h～24h至对数生长期。

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将菌液用TSB肉汤稀释至0.5麦氏浊度，菌液浓度约为1×10CFU/mL。用TSB肉汤进行10倍稀释，使细菌

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浓度达到1×10CFU/mL。

7.2.2替米考星的倍比稀释

将2560μg/mL替米考星标准储备液，用TSB肉汤依次两倍系列稀释为0.62μg/mL～1280μg/mL，配制

成含12个浓度梯度的倍比稀释液。

7.2.3含药TSA平板的制备

取18mL灭菌未凝固TSA培养基，冷却至45℃左右，加1mL无支原体胎牛血清（5%）、200μLNAD（1%）

和2mL替米考星倍比稀释液（参见本文件7.2.2），涡旋混匀，倾入培养皿，制备成替米考星TSA平板，

晾干后置于-4℃备用。

7.2.4替米考星TSA平板浓度范围

替米考星TSA平板浓度范围为0.0