动物微生物病毒感染的实验诊断.ppt

1．斑点杂交法将待测的DNA或RNA直接点在杂交滤膜上，变性后，用标记的核酸探针进行杂交。用32p或131I同位素标记的探针通过放射白显影，可直接观察。现用地高辛、生物素等非同位素物质标记，然后采用酶反应或酶免疫技术进行检测，已被越来越多的实验室广泛使用。第53页,共63页，2024年2月25日，星期天2．固相杂交技术将核酸探针包被聚苯乙烯微孔板中，加人待测的核酸序列和标记的指示探针杂交液中进行杂交，洗涤后，用酶免疫技术进行检测。第54页,共63页，2024年2月25日，星期天3.原位分子杂交技术在细胞原位暴露DNA或RNA，加入标记特异核酸探针进行杂交。通过显色技术可显示特定杂交探针在细胞内的位置和核酸的数量。第55页,共63页，2024年2月25日，星期天4.Southern印迹和Northern印迹法Southern印迹法用于DNA的杂交。提取DNA,用内切酶切割后，进行琼脂糖电泳按分子量使DNA分开，将DNA移至硝酸纤维膜上，用标记探针进行杂交。可以检测病毒DNA特异序列。Northern印迹法用于RNA杂交分析。将琼脂糖电泳后的RNA移至DBM膜上，用标记探针进行杂交。用于检测RNA或mRNA。第56页,共63页，2024年2月25日，星期天5．聚合酶链反应(PCR)选择病毒的特异保守片段作为靶基因，进行引物设计和扩增可诊断病毒性感染。选择病毒的易变区，结合RFLP，测序等技术可以对病毒进行分型和突变的研究。第57页,共63页，2024年2月25日，星期天(1)DNA病毒：可直接进行PCR扩增其特异片段。(2)RNA病毒：可通过RT-PCR技术，将RNA逆转录为cDNA，再进行PCR扩增。第58页,共63页，2024年2月25日，星期天(3)定量PCR技术：对扩增的产物进行原始标本定量，对病毒感染的诊断起到了量化的作用。同时，对研究病毒和机体之间的关系提供了参考。第59页,共63页，2024年2月25日，星期天有些病毒如轮状病毒的核酸具有典型的分节段特点。可以从标本中直接提取轮状病毒的核酸。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，观察其特有的11个核酸节段的条带排列情况，进行诊断。6．病毒核酸的直接检测第60页,共63页，2024年2月25日，星期天五、病毒检验的结果评价

通过实验手段，从标本中获得有关病毒感染的证据，从而确定病毒感染和临床疾病之间的因果关系，是病毒实验诊断的目标。第61页,共63页，2024年2月25日，星期天通过分离和鉴定获得致病性病毒，发现病毒感染的特异征象，如机体内产生特异性抗体,急性期和恢复期血清中相应的特异性抗体有4倍以上的升高，细胞内包涵体的形成等,就可得出病原学诊断。第62页,共63页，2024年2月25日，星期天感谢大家观看第63页,共63页，2024年2月25日，星期天(2)二倍体细胞株：仍保持二倍体特性。寿命一般为40～50代，如人胚肺细胞。广泛用于病毒分离和疫苗制备。第21页,共63页，2024年2月25日，星期天(3)传代细胞系：来于肿瘤细胞，染色体特征类似肿瘤细胞。常用的有人宫颈癌细胞(Hela)、人喉上皮癌细胞(Hep-2)。第22页,共63页，2024年2月25日，星期天2．鸡胚接种鸡胚是用于分离粘病毒科、疱疹病毒、痘类病毒的较为理想的材料。第23页,共63页，2024年2月25日，星期天3．动物接种动物对病毒的敏感性是不同的，选择合适动物十分重要。小鼠、乳鼠、家兔、豚鼠、猴等常用于分离病毒。第24页,共63页，2024年2月25日，星期天常用于病毒分离的细胞细胞种类可分离的病毒原代细胞非洲绿猴肾细胞人单核细胞人胚肾、肺细胞恒河猴猕猴肾细胞HSV、RSV、VZV、腮腺炎病毒、风疹病毒HIV、HTLV、HHV-6腮腺炎病毒、腺病毒ECHO、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇A、B组、RSV二倍体细胞株人胚肺成纤维细胞株WI-38、MRC—5CMV、VZV、鼻病毒腮腺炎病毒、腺病毒传代细胞系HelaHep-2Vero柯萨奇A、B组、RSV腺病毒、R