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细胞膜色谱法及其在中药筛选研究中的应用

贺浪冲，杨广德，梁明金，王嗣岑

（西安交通大学，西安710061）

贺浪冲等创立了一种新的生物亲合色谱方法—细胞膜色谱法(CellMembraneChromatography,CMC)[1,2]，多年来对其基础理论、实验方法和应用价值进行了系统、深入地研究[3,4]，并不断完善和提高。已经成为继经典放射性配体方法之后，又一种新的受体药理学实验研究方法，并成功地用于对中药复杂体系中物质基础的筛选研究。从1996年起，已将高通量色谱分离制备技术和受体细胞膜色谱筛选技术用于中药复杂体系中药效物质筛选与研究之中。通过对123种中药材、60种陕西秦巴山区药用植物进行了快速有效的筛选，已发现12种中药材和8种植物中的36个有效成分对血管内皮细胞、心肌细胞上的钙通道受体、大脑细胞上的β受体、胰岛β-细胞和A细胞等均具有不同程度的作用活性，并建立起了部分中药和药用植物的样品库和活性库。对这些活性部位和成分作了进一步的离体和整体药理实验研究，发现药理结果与模型筛选结果有良好的相关性。

一、细胞膜色谱法及其特性

1．细胞膜色谱柱的制备[2,3]

1）膜制备组织块称重，加入10倍体积的Tris-HCL缓冲液，冰浴下匀浆、过滤，10000g离心10min，沉淀用缓冲液混匀，离心2-3次，用10mmolTris-HCl和2mmolLiBr提取45min，1000g离心10min，得均匀的细胞膜悬液，用Lowrry法测蛋白含量。

2）色谱柱的制备制细胞膜的吸附等温线，计算硅胶饱和吸附量,制备相应膜固定相的初始细胞膜浓度。取活化硅胶20mg，加入膜制备，在4度摇床上震荡60min，平衡后离心分离，沉淀物用0.6mL的Tris-HCl洗涤，用低压湿法加入12mm×50mmID的不锈钢色谱柱中，将细胞膜固定于硅胶载体表面。在柱温37℃，pH=7.4的磷酸盐缓冲液平衡一段时间后准备进样分析。通过扫描电镜和能谱法研究已证实细胞膜能完全覆盖硅胶表面，不存在与硅胶的非特异结合；制成的细胞膜固定相(CMSP)

由CMC模型构成的色谱系统，实验证明：①经扫描电镜分析和表面能谱分析，CMSP表面完全被细胞膜所覆盖。②CMSP表现出普通细胞膜制剂所具有的酶活性特性，活性在比液载体内稳定。③由CMSP构成的CMC系统与通常的正相色谱和反相色谱系统不同，是一种特殊的生物色谱体系。④CMC系统具有生物活性和色谱分离双重特性。⑤与经典靶体-配体结合实验（RBA，受体功能分析法）比较，CMC法具有同样的生物亲和特性[18]。

2．药物分子与膜受体亲和力研究

在此色谱系统中，药物分子与细胞膜及膜受体的作用是多样的。自然生物膜存在有多种活性蛋白，药物分子可能与多种受体或通道蛋白结合，其容量因子（k＇）可反映药物分子与细胞膜上多种受体的协同结合效应；用容量因子反映药物分子亲和力，既包括特异结合，也包括非特异结合；保留作用的大小除了与药物分子亲和力大小有关外，可能还受其他因素如化合物极性的大小的影响，因此，必须先用药物与受体饱和结合后，才能测得其特异结合。与RBA技术相似，CMC技术也可进行配体-受体竞争性结合研究。

3．CMC模型的技术特点

1）具有特异性、饱和性、可逆性和竞争性结合等特点

根据候选小分子化合物溶液在色谱柱内保留特性,细胞膜生物亲和色谱实质反映了小分子化合物分子与膜受体蛋白分子间的相互作用，因此其结合特性均具有特异性、饱和性、可逆性和竞争性结合等特点，并具有手性识别能力。CMC法与RBA和功能受体动力学的相关研究证明，三种方法测得的7种配体及其异构体对M、α、β受体亲和力参数顺序一致，并具有明显的相关性。CMC技术已经成功用于钙阻滞药的受体-配体结合反应研究和立体异构体的识别。

2）细胞膜固定相具有细胞膜活性筛选和色谱分离的双重功效

CMC技术可对药物-受体亲和力进行定性和定量分析，同时对结合状态的化合物进行色谱分离。这种双重功效为药物筛选和分离提供了非常有效的实验平台。特别是在中药研究中，可有效地分离出中药有效成分，并进行其受体亲和力（k＇）测定。CMC技术已成功应用于中药有效成分的筛选和色谱分离[19–23]。

4）具有稳定、简捷、高效特点

CMC法与放射配体结合法比较，细胞膜受体不是处于溶液中，而是固定于硅胶载体表面上，因而方法更简便；由于色谱柱可重复使用和膜蛋白消耗量少，筛选效率高，稳定性高，变异性很小；由于不需要特殊的放射性配体，没有放射性污染；如果用激光诱导荧光检测手段，CMC法的灵敏度可超过RBS。与功能受体动力学方法相比，CMC法具有更高的灵敏度和精确度