蛋白印迹分析和总结.docx

蛋白质印迹法

一.原理：

WesternBlot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品，转移到固相载体【例如硝酸纤维素薄膜（nc膜）】上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

二. 步骤：

制胶

将清洁干净的玻璃板对齐后放入架中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（

分离胶制法：先将所需量的蒸馏水、30%AcrBis(29:1)、1MTris,PH8.8、10%SDS、依次加入离心管中，进行摇匀，再将所需量的10%过硫酸铵、TEMED加入，再次进行摇匀(注：要充分摇匀)。然后用1ml的微量加样器进行灌胶，灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度，待胶面升到接触绿带高度时即可，然后将板内气泡赶至顶部，再在胶上加一层水进行液封并置于恒温箱内，约20分钟即凝固。待分离胶凝固后倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干再配制浓缩胶。（注：操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变形。1.0mm板每板大约需5ml分离胶，1.5mm板每板大约需8ml分离胶）。

浓缩胶制法：先将所需量的蒸馏水、30%AcrBis(29:1)、1MTris,PH6.8、10%SDS、依次加入离心管中，然后进行摇匀，再将所需量的10%过硫酸铵、TEMED加入，再次进行摇匀。然后用1ml的微量加样器进行灌胶，待胶面升到玻璃板上端时即可，再将梳子插入浓缩胶中，梳子插入浓缩胶时，应确保没有气泡，待浓缩胶凝固约30分钟中后冷却至室温即可用于电泳。（1.0mm板每板大约需1.5ml浓缩胶，1.5mm板每板大约需2ml浓缩胶）。

电泳

（1）将凝胶板至于电泳槽中，往电泳槽中加入足够的电泳液后开始准备上样，上样前样品应进行离心。用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次，以免交叉污染。一般彩色蛋白加10ul,蛋白样品加20ul（蛋白样体积视情况而定）。

（2）电泳：电泳仪需先进行事先预热。电泳时间一般为2h左右，在浓缩胶部分的电泳，电压控制在40v左右（电流20mA）,时间为40分钟。在分离胶部分的电泳，电压控制在90v左右，时间约为700分钟。电泳至溴酚兰刚跑至底部接触绿带为止，即可停止电泳进行转膜，否则应适当的延长时间。（注：为减少蛋白质条带的扩散，上样后应尽快进行电泳，电泳结束后也应直接或者转印。）

转膜

剪切与胶大小的所需PVDF膜，切膜时一定要戴干净手套，因为手上的蛋白会污染膜，并置于无水甲醇溶液中进行活化，活化1min~2min，再置于转膜液中进行清洗；

在加有转膜液的器皿里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、滤纸；

将夹子打开使黑的一面保持水平。在两面上面分别垫一张海绵垫，再在上面分别垫三层滤纸，并使滤纸保持湿润状态；

剥胶：先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶先置于转膜液中，再置于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，要防止胶中含有气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，然后将黑白两面对齐并合起夹子。整个操作在转膜液中进行。（膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。）

将夹子放入转膜槽槽中，要使夹子的黑面对槽的黑面，夹子的白面对槽的红面。电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。并在转膜槽四周放入适量的碎冰以降低温度，保持所需的电流。小分子（30KD）一般用80v左右的电压（130mA）转膜30分钟，60KD左右的分子在100v左右的电压转膜60分钟，大分子(110KD)用100v左右的电压转膜90分钟。

（注：转膜时电流会随着转膜液使用的次数而不断升高，故以相同的电压不一定会做出上一次相同的效果，一般以恒流效果会较好。如果初次转膜，可以根据一般经验，即多少kD的蛋白就转多少分钟，再根据结果调整时间）。附：为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，最好使用预染。传统方法是将膜用1×丽春红染液染5min（于脱色摇床