(1.4)--离子交换层析生物化学实验.ppt

离子交换层析技术

目录01层析基本介绍02理论依据03具体操作04应用及发展

层析基本介绍Part01

层析基本介绍总论01层析的萌芽02层析的第一次真正实现03色谱的发展04

层析的基本介绍01总论层析即色层分析也称色谱。色谱分析法是一类针对复杂试样的分离分析方法的总称，是现代分离分析的重要方法之一。所有的层析系统都由两个相组成：固定相（静相）以及流动相（动相）。随着色谱技术的发展，至今，固定相已可以是固体，或是液体（将液体固定在固态载体或色谱柱管壁上）；而流动相可以是液体，也可以是气体；分离对象也远不限于有色物质的范畴。色谱分析的关键是分离，依据混合物中各组分与固定相（或流动相）的分子间作用力的差异，使各组分在柱内随流动相的移动速率产生差异，最终得到分离的结果。色谱分析法可按固定相和流动相的形态分为气液色谱、液液色谱及固固色谱。按机理可分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱等。按固定相色谱又可分为柱色谱和平面色谱等。我们在课上分离纯化蛋白质的技术是离子交换柱层析。

层析的基本介绍02层析的萌芽1850年龙格(F.F.Lunge)观察到将一滴染料混合物溶液滴到吸墨纸上时会扩散成一层层的圆形环;申拜恩(C.F.Schoenbein)在1861年注意到,如果把一滴无机盐混合溶液滴在一张滤纸上,那么各种盐分会以不同速度向四周扩散;德伊(D.T.Day)在1897年、克利特卡(S.K.Kritka)在1900年初发现把石油简单地通过碳酸钙的细粉柱,就会分离为不同馏分。这些工作可以说是平面色谱或者柱色谱的萌芽,但直到20世纪初,人们只是利用吸附现象实现了简单的分离。

层析的基本介绍03层析的第一次真正实现茨维特于在题目为“叶绿素的物理化学研究”的研究中，观察到了色谱现象，茨维特在一根玻璃管的底部塞上一团棉花,在管中填入粉末状吸附剂,例如碳酸钙等,然后把该吸附管与吸滤瓶连接,把有色植物叶子的石油醚萃取液倾注到管内的吸附剂上面,然后用纯石油醚洗脱,植物叶中的几种色素就在管内形成不同种颜色的色带。1903年在华沙国际学术会议上用俄文发表的分离叶绿素的研究结果更详细地描述了实验装置和分离过程,他采用了109种有机和无机吸附剂来分离叶绿素等色素,并讨论了吸附材料和淋洗过程对吸附分离的影响。在这篇论文中,茨维特第一次认识到一种新的色谱类型,即洗脱色谱,并且用光谱方法检测了分离后的物质。

层析的基本介绍04色谱的发展1931年,著名的奥地利裔德国化学家R.Kuhn及其合作者E.Lederer使用了茨维特的液-固色谱法,用碳酸钙吸附剂填充的玻璃管(内径1cm,长度15cm)对来自蛋黄的30mg叶黄素样品经过3次分离,得到了3种胡萝卜素异构体,即α-胡萝卜素(mp188℃)、β-胡萝卜素(mp184℃)、γ-胡萝卜素(mp178℃),从而证明蛋黄叶黄素是氧化胡萝卜素的混合物,同时也证明了茨维特的方法可以实现快速有效的分离，并因胡萝卜素和维生素方面的研究获得了诺贝尔化学奖。乌克兰科学家N.A.Lzmailov和M.S.Shraiber在研究中发现吸附色谱柱模式用薄吸着剂中的过程所代替。在这种情况下，分析时间相当长缩短了试验材料、吸附剂的消耗、检测试剂减少。通过实验他们发现最佳薄层厚度和最佳吸附剂氧化铝。并且他们在1938年发明了薄层色谱。

层析的基本介绍04色谱的发展20世纪40年代初,有3组科学家同时研究气体吸附色谱。首先是G.Hesse在1941-1942年采用装有淀粉的玻璃管分离了氮气中的溴和碘[21],后来又用硅胶填充柱和二氧化碳流动相分离了一些脂类化合物以及共沸物和顺反异构体。G.Damkǒhler和H.Theile分离了载气流中的甲醇-乙醇混合物以及环己烷和苯的混合物,他们还将甘油涂在吸附剂上以降低吸附活性。第三组科学家是E.Cremer及其学生A.Kunte等人,他们研究了乙炔加氢的动力学并分析了乙炔和乙烯的混合物。Cremer的学生F.Prior则采用Kuhn在1947年开发的简单色谱装置,用炭黑作为固定相分离了空气中的二氧化碳]。Cremer的另一个学生Microchem则分离了氮气、乙烯和乙炔,采用的是热导检测器。Cremer和她的学生在二战期间还设计制造出第一台气-固色谱仪。

层析的基本介绍04色谱的发展1936年获博士学位后,Martin和Synge一起用对流分配的方法分离氨基酸。他们把用水饱和的硅胶装填在30cm长的柱管中,用氯仿做流动相,将乙酰氨基酸加到柱上,同时加入甲基橙来监控氨基酸在柱管中的移动。为了从理论上解释色谱分离过程,他们发展了色谱的塔板理论。二十世纪五