(1.6)--蛋白质含量的测定.ppt

蛋白质含量的测定发展历史各种方法的原理影响因素优缺点

蛋白质的种类很多、数量很大、分子组成及结构不均一、分子量相差也很大，且功能各异，因此给好的蛋白质定量测定方法的建立带来了许多具体困难。发展历史凯氏定氮法：凯道尔，1833考马斯亮蓝染色：Bradford，1976传统银染法:Sambrook，1996

发展历史

物理性质紫外吸收法

紫外吸收法-原理：蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收峰在280nm处，其吸光度(即光密度值)与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的吸光度与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。

紫外光吸收法影响因素：若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质时，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。此外，由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化，因此要注意溶液的pH，测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。吸光度最好在0.05～1.0，在0.3附近的精度最高。浑浊溶液应采取过滤(0.2μm过滤)或离心使溶液澄清，或者用A280-A310进行修正。

紫外光吸收法优点：可测定0.1～0.5mg/mL的蛋白质溶液，操作简便，测定迅速，不消耗样品，低浓度的盐，例如生化制备中常用的(NH4)2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定。特别适用于柱色谱洗脱液的快速连续检测，因为此时只需测定蛋白质浓度的变化，而不需知道其绝对值。缺点：测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。

化学性质凯氏定氮法双缩脲法Folin-酚法BCA法

凯氏定氮法-原理：在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气蒸馏出来并为过量的硼酸液吸收，再以标准盐酸滴定，就可计算出样品中的氮量。通过测定物质中的含氮量便可估算出物质中的总蛋白质含量(假设测定物质中的氮全来自蛋白质)，即:蛋白质含量=含氮量/16%。

凯氏定氮法影响因素：若样品中其他含氮化合物含有非蛋白质却有氮的化合物，也会被认为是蛋白质。优点：所测的结果为蛋白质绝对浓度而非相对浓度，可用于标准蛋白质含量的准确测定。干扰少。缺点：理论上存在被不法分子含氮化合物利用的可能性。

双缩脲法-原理：双缩脲(Nil，CONHCONH3)是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO，结合形成红紫色络合物，称为双缩脲反应。蛋白质分子中含有肽键，与双缩脲结构相似，故能发生双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，蛋白质的种类虽不同，但发色率差别不大，组氨酸以外其它游离的氨基酸、二肽等不显色（除双缩脲、一亚氨基双缩脲、二亚氨基双缩脲、氨醇、氨基酸酰胺、丙二酰胺等少数化合物以外）非蛋白质均不显色，可以看做这是蛋白质的特有反应，故可用来测定蛋白质含量。

双缩脲法影响因素：干扰测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。优点：测定较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，干扰物质较少。缺点：灵敏度差、测定范围小。

Folin-酚试剂法（Lowry法）-原理：酚试剂法就是来自酚试剂(磷铜酸、磷钨酸的混合液)，在碱性条件下，和蛋白质中芳香族氨基酸的呈色反应与双缩尿反应的复合方法。磷钼酸盐一磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色(钼兰和钨兰的混合物)。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。

Folin-酚试剂法影响因素：Folin-酚试液仅在酸性pH条件下稳定，但第二步的还原反应只在pH：10的情况下发生，故当酚试剂加到碱性铜-蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应即能发生，否则会使显色程度减弱。优点：灵敏度高，比双缩脲法高100倍。缺点：干扰物质较多，还原物质、酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。时间较长。

BCA法-原理：依据蛋白质分子在碱性溶液中将Cu2+还原为Cu，BCA(2，2-联喹啉4，4-二羧酸)与Cu+结